小鼠单核巨噬细胞的培养与处理及应用！

一、背景

小鼠单核巨噬细胞源自Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤。sIg-,Ia-抗原、Thy-1.2表面抗原阴性。此细胞株不分泌可检测到的病毒颗粒，XC斑点形成试验阴性。可以胞饮中性红并吞噬乳胶颗粒与酵母聚糖。可以抗体依赖性地分解绵羊红血球与肿瘤靶细胞。LPS或PPD处理2天可诱导分解红血球但对肿瘤靶细胞无作用。

二、细胞培养步骤

培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；北美胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

三、细胞处理

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、用细胞刮铲将细胞从培养瓶瓶壁上轻刮细胞使细胞脱落，将细胞悬液抽出到离心管内。

3、在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

四、应用

用于CCK-8对LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞内质网应激的影响研究：

择可稳定传代的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞探讨这一科学问题,对于阐明CCK-8的抗炎机制以及药物开发应用具有重要意义。

方法：

1、选用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞作为研究对象。

2、实验分组:将小鼠RAW264.7细胞按随机数字表法分为6组:对照组（Con组）:用无血清DMEM/高糖培养基培养;LPS组:用含0.5μg/ml LPS无血清的培养基培养;CCK-8组:用含10-6μmol/ml CCK-8无血清培养基培养;CCK-8+LPS组:预先用含10-6μmol/ml CCK-8处理10min,然后加LPS的无血清培养基处理细胞;CCK-8受体拮抗剂-1+CCK-8+LPS组:（devazepide+CCK-8+LPS）:预先在加入CCK-8和LPS前10min加入含10-3M devazepide的无血清培养基培养;CCK-8受体拮抗剂-1组（devazepide组）:用含10-3M devazepide的无血清培养基培养。处理所用药物的剂量和时间均根据预实验结果。

3、收集细胞,提取总蛋白,用Western blot方法检测内质网应激标志分子GRP78/Bip、CHOP蛋白的表达情况;提取总RNA,用RT-PCR方法检测RAW264.7细胞内XBP-1s m RNA表达的变化情况;收集细胞上清,采用ELISA技术检测RAW264.7细胞上清中IL-1β的含量。

4、数据用均数±标准差（Mean±SD）表示,用SPSS21.0软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA）,用最小显著差法（least significant difference,LSD）作两两比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果：

1、观察不同浓度LPS及LPS处理不同时间对细胞中GRP78、CHOP蛋白表达的影响RAW264.7细胞经不同浓度LPS（0.5、1.0、1.5μg/ml）作用24 h后,GRP78、CHOP的表达与对照组相比均明显增高（P<0.05）,而经LPS三种浓度处理后GRP78、CHOP的表达水平组间比较无统计学差异,（P>0.05）。考虑LPS对细胞的毒性作用,所以选择0.5μg/ml作为后续实验的药物浓度。RAW264.7细胞经0.5μg/ml LPS作用不同时间（3、6、12、24h）后,CHOP的表达水平较对照组均有所增加,且CHOP表达量在12h达最高峰（P<0.05）;GRP78/Bip表达与CHOP的表达结果相一致。根据以上结果确定最终的实验条件为0.5μg/ml LPS作用细胞时间为12h。

2、观察CCK-8对LPS诱导的RAW264.7细胞XBP1-s m RNA表达的影响XBP1m RNA表达水平升高标志IRE1活化,ERS启动。与对照组相比,LPS组XBP1-s m RNA表达明显增高。与LPS组相比,CCK-8+LPS组XBP1m RNA的表达明显降低（P<0.05）,而预先应用CCK-8的1受体阻滞剂devazepide可明显抑制CCK-8的作用。单独应用CCK-8或devazepide,XBP1m RNA表达水平与对照组相比无明显差异（P>0.05）。该结果表明CCK-8通过受体1抑制LPS诱导的RAW264.7细胞IRE1活化。