FADU人咽鳞癌细胞的培养方法与应用！

一、背景

FADU人咽鳞癌细胞是于1968年从一位印度下咽骨肿瘤患者的钻孔活组织切片中建立的。在FaDu细胞中发现细胞质中含有成束的细丝，并且FaDu细胞分界上的桥粒特别突出。生长培养基：MEM＋10S＋1%P/S；培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%，温度：37。

二、细胞培养方法

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

将冻存管在37温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

将冻存管放入程序降温盒，放入-80冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

三、应用

用于FaDu人咽鳞癌裸鼠移植瘤放疗过程中肿瘤再增殖的实验研究：

对FaDu人咽鳞癌荷瘤裸鼠放疗过程中的再增殖现象进行验证，再于放疗期间应用18F-FLT PET显像观察裸鼠体内肿瘤的增殖情况，并以肿瘤病理增殖指标Ki-67、溴化脱氧尿嘧啶核苷（BrdUrd）的变化为金标准对18F-FLT PET能否监测放疗过程中的肿瘤再增殖现象进行验证。

材料和方法：应用4-6周龄,体重18-20g的Balb/c雌性裸鼠,于裸鼠右后肢皮下接种FaDu人咽鳞癌细胞，建立裸鼠移植瘤模型。裸鼠成瘤并达到入组标准后，按放疗持续时间不同随机分为五组：不照射组【1组】，照射12次/12天【2组】、照射18次/18天【3组】、照射12次/24天【4组】、照射18次/36天【5组】。放疗方式采用常规分割放射治疗，6MeV电子线，3.0Gy/次，每日或隔日照射。放疗期间应用游标卡尺每3天测量一次肿瘤体积。

对照组和放疗结束的不同时间点各给予一次18F-FLT micro-PET显像，分析FLT摄取参数（SUVmax、SUVmean、T/NT）的变化。PET显像结束后处死各组裸鼠，以免疫组织化学方法检测各组肿瘤组织中Ki-67、BrdUrd的表达情况。

研究结果：随着常规分割放疗时间的增加，与对照组相比，Ki-67和BrdUrd标记指数在放疗初期逐渐降低（P值均<0.05），在放疗后期又逐渐升高（P值均>0.05）。随放疗时间延长，与对照组相比，SUVmax、SUVmean、T/NT值在放疗的12次/12天组（P值均<0.05）和18次/18天组（P值均<0.05）出现显著降低；然而在12次/24天组和18次/36天组，SUVmax、SUVmean、T/NT值与对照组相比差异无统计学意义（P值均>0.05）。

SUVmax、SUVmean、T/NT值与病理增殖指标（Ki-67和BrdUrd）的相关性分析显示均呈显著相关（与Ki-67，r:0.728-0.744，P值均<0.05；与BrdUrd，r:0.770-0.842,P值均<0.05）。

研究结论：1、通过组织病理证实了FaDu人咽鳞癌荷瘤裸鼠在放疗过程中出现了加速再增殖。

2、应用18F-FLT micro-PET能够监测出放疗过程中的肿瘤再增殖。

3、分次放疗过程中18F-FLT摄取参数（SUVmax、SUVmean、T/NT）与病理增殖指标（Ki-67和BrdUrd）的变化呈显著相关。