兔子二胺氧化酶(DAO)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

兔子二胺氧化酶(DAO)ELISA试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中待测二胺氧化酶(DAO)的含量。

二、实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中兔子二胺氧化酶(DAO)水平。用纯化的兔子二胺氧化酶(DAO)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入待测物质，再与HRP标记的待测物质抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测物质呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中待测物质浓度。

三、操作步骤

1、使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2、根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3、加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育1小时。

4、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5、每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37温育30分钟。

6、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7、每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37温育10分钟。避免光照。

8、取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9、在450nm波长处测定各孔的OD值。

四、应用

用于D—乳酸及二胺氧化酶对判断克罗恩病炎症活动性的临床价值研究：

临床上目前常用的评价肠道黏膜炎症活动性的直接方法是内镜检查,但是内镜检查成本高、侵入性大、耗时长、有多重并发症的风险;检测血沉（erythrocyte sedimentation,ESR）、C反应蛋白（c reactive protein,CRP）是判断体内有无活动性炎症的常用间接检查方法,但这两项指标的特异度较差,病人出现感染、结缔组织疾病等情况时都会增高。粪便钙卫蛋白也有助于判断肠道的炎症活动度,但影响因素多,检测结果常不稳定。

因此开发新的灵敏度和特异度高、成本低、检测方法简便的生物标记物作为评估CD炎症活动性的指标很有必要。D-乳酸（D-Lactate,D-LA）及二胺氧化酶（diamine oxidase,DAO）是反映肠道屏障功能的两项指标,是否与CD的炎症活动性相关尚不明确。

探讨D-乳酸及二胺氧化酶在判断克罗恩病炎症活动性中的应用价值。

方法：纳入59例CD患者,采用酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）定量检测患者血清D-LA及DAO的水平,以同期28名体检正常人群为健康对照组,分析不同临床分期CD患者血清D-LA与DAO水平,计算D-LA,DAO与炎症评分的相关性,同时以受试者工作特征（Receiver operating characteristic,ROC）曲线评价这两项指标对于CD活动性的诊断效能。

结果：活动期和缓解期CD患者血清中D-LA的水平分别为（16.08±4.80）mg/L和（11.16±3.17）mg/L,差异具有统计学意义（t=4.67,P<0.001）。活动期和缓解期CD患者血清中DAO的水平分别为（11.01±4.49）U/L和（7.70±3.44）U/L,差异具有统计学意义（t=3.18,P<0.05）。CD组患者D-LA和DAO水平与CD活动指数（Crohn’s disease activity index,CDAI）呈正相关（r=0.68、0.53,P<0.05）。

D-LA和DAO单独诊断CD活动性的ROC曲线下面积（Area under curve,AUC）分别为0.815、0.748,两者的诊断效能与ESR、CRP均无显著差异（P>0.05）,而通过Logistic回归模型生成联合预测因子（combining predictors,Comb）作为分析指标,D-LA、DAO、CRP及ESR四者联合诊断时,计算对应的ROC曲线下面积达0.861（0.746,0.937）,显著优于CRP或ESR单独检测（P<0.05）。

结论：D-LA及DAO对于CD炎症活动性具有良好的诊断价值。D-LA、DAO、CRP及ESR联合应用可显著提高诊断效能。