大鼠组蛋白乙酰转移酶1(HAT 1)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

大鼠组蛋白乙酰转移酶1(HAT 1)ELISA试剂盒运用双抗体夹心ELISA酶联免疫法定量测定血清、血浆或其它相关生物液体样本中组蛋白乙酰转移酶1(HAT 1)的含量。

二、实验原理

用抗大鼠HAT 1抗体包被于酶标板上，实验时标本或标准品中的HAT 1会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗大鼠HAT 1抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗大鼠HAT 1抗体与结合在包被抗体上的大鼠HAT 1结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，TMB在辣根过氧化物酶的催化下现蓝色，加终止液后变黄。用酶标仪在450nm波长处测OD值，HAT 1浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线求出标本中HAT 1的浓度。

三、样本处理及要求

1、血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2、血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3、尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

四、实验步骤

1、从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；3.待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

4、随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

五、应用

用于可逆性组蛋白乙酰化修饰在人WT1基因转录调控中的作用及其分子机制研究：

探究可逆的组蛋白乙酰化修饰是否参与WT1基因的转录调控,并试图探讨其分子机制。通过一系列瞬时转染和相对荧光素酶活性分析以及RT-PCR实验,我们发现组蛋白乙酰转移酶p300/CBP不仅能促进WT1启动子和内部增强子的活性,而且能提高内源WT1 mRNA的表达水平。

E1A蛋白能抑制p300对WT1报告基因转录激活的促进作用,而其突变体E1A delta 2-36因不能与p300/CBP结合而没有这种作用,这也间接地证明了p300/CBP能促进WT1基因的表达。我们的结果还表明p300/CBP可分别与转录因子Sp1、c-Myb和Ets-1协同地促进WT1报告基因的转录活性。

通过WT1内部增强子克隆方向不同的质粒,证明p300/CBP促进WT1报告基因的转录激活不受内部增强子方向的影响。此外,通过采用HAT区缺失突变的p300表达质粒的转染实验,证明了p300/CBP的组蛋白乙酰转移酶活性在WT1基因转录调控过程中发挥重要作用。通过染色质免疫沉淀实验（ChIP）,发现p300/CBP能够提高WT1内部增强子处组蛋白H3的乙酰化水平。另外,我们的结果表明另一种组蛋白乙酰转移酶P/CAF不仅能促进WT1报告基因的表达,而且在此过程中与p300/CBP具有协同作用。

在它们协同地促进WT1报告基因表达的过程中,p300/CBP和P/CAF的HAT活性都非常重要。另一方面,验证了六种人组蛋白去乙酰化酶（HDAC1-6）对WT1报告基因表达水平的影响。

结果表明,HDAC4和HDAC5不仅能抑制WT1报告基因的活性,而且能下调内源WT1 mRNA的表达水平。在瞬时转染和报告基因活性分析中,HDAC4和HDAC5能抑制p300对WT1报告基因转录激活的促进作用。