人包皮成纤维细胞的培养方法与实验步骤！

人包皮成纤维细胞，从新生儿包皮中分离建立，可用作饲养层细胞，用于支持胚胎干细胞的生长或维持胚胎干细胞的未分化状态。

细胞简介

平台编号：Bio-107462

英文名称：HFF；HFF-1

中文名称：人包皮成纤维细胞

细胞描述：外国人新生男孩包皮成纤维细胞，每支细胞量0.4×106，可供HN4、HN1、H1、H9等hES的饲养层细胞使用。冻存时为P18代。建议在P30代以前使用。每个批次均通过本库支原体检测，结果为阴性。经本库STR检测无误。STR鉴定结果为：D5S818: 11,11；D13S317: 11,13；D7S820: 9,10,12；D16S539: 10,12；vWA: 14,15,17,19；THO1: 7,9,9.3；Amelogenin: X,Y；TPOX: 8,11；CSF1PO: 7,11,12,13

规格：T25方瓶或1ml冻存管

细胞数量：1×10^6

组织来源：人皮肤

生长方式：贴壁生长

细胞形态：成纤维样

培养液：H-DMEM+10S+1%P/S

培养条件：37，5%CO2

运输方式：常温运输（T25方瓶）或干冰运输（冻存管）

实验材料

1、细胞来源：新生儿包皮；

2、不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3、0.25%胰蛋白酶-0.02TA溶液：两者比例为1：1，用D-Hanks液配制；

4、0.02%大豆胰蛋白酶抑制剂：用DMEM培养液配制；

5、生长基质：人纤维连接蛋白，按10μg/cm2 包被培养皿；

6、DMEM培养液：DMEM培养基，加10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml；

7、DMF培养液：为无血清化学限定性培养液。基础培养基为1：1的DMEM和Ham F12混合培养基，加入EGF100ng/ml、胰岛素100 ng/ml、转帖蛋白μg/ml、凝血酶1μg/ml、抗坏血酸10μg/ml、氢化可的松5×10-5mol/ml、卵清蛋白1mg/ml和微量元素。添加青霉素100 IU/ml、链霉素100μg/ml；

8、无菌消毒手术器械、35mm培养皿、三角瓶、100目网筛；

9、离心管（15ml、50ml）

实验方法

1、分离表皮和真皮；

在无菌条件下取新生儿包皮，用生理盐水洗净皮片上的血迹；

将皮片放入盛有0.25%胰蛋白酶-0.02TA溶液的三角瓶中，密封后存放于4冰箱中18h；

转移皮片至培养皿中，小心分离表皮层并弃之；

用DMEM清洗真皮片，备用；

2、制备细胞悬液；

充分剪碎真皮片，加入胶原酶溶液，于37孵育1h；

用吸管反复吹打组织块，分散细胞；

经100目筛网过滤消化液，收集滤过的细胞悬液；

离心细胞悬液（800r/min，5min），弃上清液；

用DMEM培养液将沉淀的细胞团制成细胞悬液；

细胞计数，调整细胞密度；

3、有血清培养：原代细胞和传代后的1—3代细胞用10%胎牛血清的DMEM培养液维持培养；

以5×10-5 个/ml的密度将细胞接种于培养瓶中。于37、5%CO2 培养箱内培养。每2—3d换液一次；

原代培养至成纤维细胞汇合成单层后，按常规方法传代；

4、无血清培养：用DMF培养液支持已建立细胞系的包皮成纤维细胞的生长和增长；

取在含血清条件下已生长汇合成片的培养物，弃培养液。用PBS清洗3次，尽量除去残留血清；

用0.25%胰蛋白酶-0.02TA溶液消化分散细胞。在镜下观察到细胞变圆后，加入大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化；

加入DMF培养液，用吸管吹打分散细胞。调整细胞密度；

取已包被人纤维连接蛋白的35mm培养皿，每皿接种5×104 个细胞。于37、5%CO2 的培养箱内培养。每2—3d换液一次；

细胞长满基质表面后，按常规方法传代。