豚鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

豚鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒运用双抗体夹心ELISA酶联免疫法定量测定血清、血浆或其它相关生物液体样本中超氧化物歧化酶(SOD)的含量。

二、实验原理

是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被豚鼠超氧化物歧化酶(SOD)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的豚鼠超氧化物歧化酶(SOD)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

三、样本处理要求

1、血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2、血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3、尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4、细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

四、操作步骤

1、取出试剂盒，室温（20-25）放置30分钟。

2、分组：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准品组（6个浓度）、空白孔、待测样品组。注：为减少实验误差，保证准确性，建议设置复孔。

3、加样：依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入50ul的蒸馏水；其余微孔中加入50ul的待测样本。

4、加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入100ul的酶标溶液（空白对照孔除外）。

5、温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于37恒温孵育1小时。

6、洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置15-30s，充分清洗酶标板5次，用吸水纸彻底拍干。

7、显色：各孔加入显色剂A液50ul后，再加入显色剂B液50ul。

8、终止：25-37下避光反应10-15分钟，加入50ul终止液。9.读板：在450nm波长读取各孔的OD值。

五、应用

用于电针耳穴对豚鼠老年性聋耳蜗核、下丘和听皮层中SOD表达的影响研究：

构建D-半乳糖老年性聋豚鼠模型，探讨超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在豚鼠老年性聋发病中的作用及电针耳穴对老年性聋的防治作用和机制。

方法：采用成年杂色豚鼠（体重300550g）30只，随机分成三组：对照组10只，D-半乳糖模型组10只，D-半乳糖+电针组10只。采用2年杂色豚鼠（体重600900g）10只作为老年组。豚鼠饲养一周后，D-半乳糖模型组给予D-半乳糖（300mg/kg）颈背部皮下注射，每日一次，连续六周；D-半乳糖+电针组给予等比例体重的D-半乳糖颈背部皮下注射，同时给予电针听宫和翳风两穴位，每日一次，连续六周；对照组给予等量生理盐水颈背部皮下注射，每日一次，连续六周；老年组低噪声环境下饲养。造模制备后于我科门诊听力学中心进行听性脑干反应（ABR）测定后处死，取每组豚鼠的耳蜗核、下丘和听皮层，考马斯亮兰测定蛋白含量，分光光度仪检测上述组织中SOD的表达情况，计算SOD的活性。各组部分听皮层迅速置于4%多聚甲醛液中固定，石蜡切片HE染色观察各组中听皮层神经元的形态。数据采用方差分析方法进行统计学分析。

结果：1、D-半乳糖模型组和老年组豚鼠均出现老化症状：听力逐渐减退、食欲下降和脱毛等现象提示造模成功。

2、ABR测定结果：正常对照组的ABR阈值为39.00±7.38dB SPL.D-半乳糖模型组、D-半乳糖+电针组和老年组的ABR阈值分别79.44±6.62、70.00±5.88和81.88±4.43dB SPL（各实验组和老年组与正常对照组比较，P＜0.001）。

3、超氧化物歧化酶SOD活性测定：与正常对照组比较，D-半乳糖模型组和老年组，耳蜗核、下丘和听皮层中SOD活性均下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；与D-半乳糖模型组比较，D-半乳糖+电针组，三个部位的SOD活性均增高（P＜0.01）。