激素脱落酸(ABA) ELISA KIT的应用！

一、背景

激素脱落酸(ABA)ELISA KIT运用竞争法ELISA法定量测定血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体中ABA含量。

二、样品收集

1、血清：全血样品于室温放置2小时或4过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2、血浆：抗凝剂推荐使用EDTA或肝素，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3、细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

三、操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品稀释液100μL，余孔分别加样品稀释液50ul和样品50μL，注意不要有气泡，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37孵育30分钟。

2、洗板3次，弃去液体，甩干或吸干。每个孔中加入配制好的酶标抗体工作液100μL（在使用前30分钟内配制），酶标板加上覆膜，37温育30分钟。

3、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，大约350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4、提前将TMB A组分和B组分37温育15分钟

5、按用量1：1混合TMB A组分和B形成TMB工作液（用干净的枪头分别吸取B组分和A组分），每孔加(TMB工作液)90μL，酶标板加上覆膜37避光孵育7-10分钟（根据实际显色，情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。

6、每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

7、立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

8、实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。

四、应用

用于植物激素脱落酸在草莓果实成熟着色上的研究：

实验以‘红颜’草莓为材料,从坐果开始通过不同浓度NDGA（nordihydroguaiaretic acid,去甲二氢愈创木酸）抑制果实中ABA的合成,以ABA处理为正对照,清水处理为CK,研究草莓果实成熟着色过程中ABA的作用。通过酶联免疫法测定不同处理下果实中ABA的含量；高效液相色谱法测定不同处理下草莓果实中主要花色苷天竺葵素葡萄糖苷的含量、蒽酮比色法测定糖的含量、酸碱滴定法测定酸的含量；同时结合荧光定量PCR研究了控制ABA合成代谢的相关酶基因FaNCED,FaCYP707A1、FaBG1以及FaCHLH在草莓果实成熟发育过程中的表达模式,分析它们与ABA的关系。

结果表明：

1、NDGA抑制了草莓果实中ABA的合成,处理浓度越大抑制作用越明显；外源ABA处理促进了果实中ABA含量的升高。草莓果实中的ABA含量与糖、天竺葵素葡萄糖苷等密切相关,与酸含量的并没有直接关系。草莓果实中高浓度的ABA有利于糖和天竺葵素葡萄糖苷的形成。

2、草莓果实中的ABA含量变化呈‘N’字型趋势。从坐果开始到完全褪绿阶段ABA含量升高花后21d达到第一个峰值,略微调整下降后,随着果实的着色又恢复上升趋势,到果实全红时期含量最高。糖含量和天竺葵素葡萄糖苷总体均呈现升高的趋势,酸含量总体呈下降趋势,并且这两种趋势变化在果实着色期间表现更加明显。

3、通过改良的CTAB法提取草莓果实总RNA,反转录为cDNA,并设计FaNCED、FaCYP707A1、FaBG1、FaCHLH四个ABA合成代谢关键基因的定量PCR引物。以反转录的cDNA为模板,研究上述四个基因在草莓花后7d、14d、21d、28d、32d的表达模式。结果表明：FaNCED表达量总体呈上升趋势,在花后7d-14d表达量不高,在花后21d迅速上升,28d有所降低,32d又快速升至最高水平；FaBG1和FaCYP707A1随草莓果实的成熟表达量逐渐降低,在着色期以前果实的褪绿阶段FaBG1和FaCYP707A1均高水平表达,着色期以后FaBG1一直处于极低的表达水平；FaCYP707A1随着果实的着色,表达量略微升高,在果实全红时期又迅速降至最低；FaCHLH在果实发育的整个阶段,不管是褪绿还是着色过程都有稳定表达,较于褪绿阶段其着色时期的表达量相对较低,在花后21d表达量最低。

综合以上结果可以得出：FaBG1主要与坐果和果实的褪绿有关,参与草莓果实早期发育阶段ABA的积累；着色期以后果实ABA的积累主要与FaNCED有关；FaCHLH与果实中ABA信号的传导有关促进了糖和花色苷的积累。