丙二酸含量试剂盒的测定步骤与应用！

 

一、背景

 

丙二酸含量试剂盒是利用相色谱法检测血清（浆）、红细胞、动物组织样本、培养细胞、细菌、植物组织等样本中丙二酸含量。

 

样本收集与前处理：

 

血清（浆）可直接测定。

 

红细胞：需按照试剂盒中说明书上红细胞的测定方法进行提取后测定。

 

动物组织样本：可用生理盐水按重量体积比制备成组织匀浆液，离心取上清测定。

 

培养细胞、细菌、植物组织：常用PBS作为匀浆介质破碎后离心取上清测定。

 

二、产品特点如下

 

1、快速简便：全程约50分钟，可测100例左右样本。

 

2、取样量微：本法取手指或耳垂等末梢血20ul～50ul即可测红细胞中的SOD，只需2ml静脉血可测白细胞中的SOD及血小板中SOD，只需50mg左右组织就可测组织匀浆、胞浆中的SOD，0.2g组织可测线粒体及微粒体中的SOD。

 

3、灵敏度高：IC50=0.05g/ml，是邻苯三酚法的18倍。

 

4、稳定性好：试剂盒2～8存放6个月有效。

 

5、再现性好：变异系数CV=1.7%。

 

6、回收试验：X=103.3%。

 

7、受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。

 

三、测定步骤

 

1、加样

 

除包被外都需45度加样

 

加样体积要准确

 

管底加样，不能加在管壁上

 

加样时不能产生气泡

 

2、温浴

 

加标本后和加结合物后，应立即放入按规定的反应温度的水浴箱。

 

各ELISA板不应叠在一起。

 

为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的金属湿盒中。

 

加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20，ELISA板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。

 

3、洗涤

 

洗涤在ELISA过程中不是反应步骤，但却是决定实验成败的关键。

 

目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。

 

4、读板

 

阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。

 

如用酶标仪测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质量和软件的算法。

 

四、应用

 

用于甲基丙二酸血症患者血浆循环microRNAs表达谱研究：

 

采用微阵列基因芯片检测MMA患者血浆循环microRNAs的表达谱水平，分析microRNAs的差异表达，初步探索血浆循环microRNAs在MMA发病机制中的表达规律，旨在寻找以microRNAs为代表的MMA新的生物标记物和治疗评价指标。

 

方法：选取晚发型维生素B12有效型MMA患者10例，设为MMA组，其中男6例，女4例，平均年龄13.0±3.5岁；均经气相色谱-质谱（GC/MS）复查尿、血中甲基丙二酸分析值；选择患者未患病的健康亲属8例作为健康对照组，其中男4例，女4例，平均年龄12.6±2.1岁。常规留取血浆，抽提microRNAs，采用实时定量PCR（real-time PCR）法评价样本质量；微阵列基因芯片检测各组血浆microRNAs的表达水平。

 

结果：

 

1、GC/MS结果提示，MMA组治疗前尿甲基丙二酸值倍率2360.532±1589.506，治疗后所有患者尿甲基丙二酸值倍率均不同程度的降低，为624.540±420.946，两者有显著性差异（P<0.01）。对照组尿甲基丙二酸值倍率均小于100，为8.284±2.615，与MMA组治疗前、后均有显著性差异（P<0.01）。

 

2、Real-time PCR结果提示，各组样本血浆hsa-miR-16、hsa-miR-192的Ct值在参考Ct值范围，融解曲线正常，说明血浆样本中提取的RNA符合实验要求，可进入下游芯片实验。

 

3、芯片统计学分析结果提示，对照组和MMA治疗前组共有129个microRNAs表达有显著性差异（P<0.01）。MMA治疗前组较对照组共有19个microRNAs上调、63个microRNAs下调。

 

4、芯片统计学分析结果提示，对照组和MMA治疗后组共有183个microRNAs表达有显著性差异（P<0.01）。MMA治疗前组较对照组共有37个microRNAs上调、88个microRNAs下调。

 

5、芯片统计学分析结果提示，MMA治疗前组和MMA治疗后组共有127个microRNAs表达有显著性差异（P<0.01）。MMA治疗后组较治疗前组共有2个microRNAs上调、71个microRNAs下调。

 

结论：

 

1、MMA患者血浆循环microRNAs存在多个microRNAs表达异常；

 

2、血浆循环microRNAs有可能成为MMA的生物标记物。