植物总蛋白提取试剂盒(2D电泳用)的应用！

一、背景

植物总蛋白提取试剂盒(2D电泳用)由优化细胞裂解液和0.6 ml离心管柱组成，能够迅速从植物组织（叶片，种子，柔软的茎和根等）中提取总蛋白。试剂盒同时提供天然和变性两种不同的裂解液，适用于不同下游实验，可供选择。利用离心管柱提取技术，可从20-200mg植物组织中提取总蛋白质，操作时间5-8分钟，得率可达2-8mg/ml。

二、操作方法

以下步骤是从50-200mg植物组织（叶片，种子，软茎和根）中提取，干燥的种子样品需要在水中浸泡2天。如果起始量较大或者较小，需按比例调整相应裂解液的用量。

1、将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2、植物叶片样品，取50-200mg新鲜组织，剪碎，卷起或者折叠减小体积放入离心管柱套管中，用吸头反复挤压50-60次（样品小于50mg此步骤可忽略），接转第3步骤。种子样品（新鲜或冷冻），软茎，用锋利的刀片将其切成小块放入离心管柱套管中，用塑料研磨棒扭转研磨1分钟（大约60次），接转第3步骤。

3、加入50-100ul变性裂解液，用塑料研磨棒扭转研磨50-60次（注意：塑料研磨棒可以重复使用，用蒸馏水彻底冲洗干净，用纸巾擦干）。

4、盖上盖子，室温孵育1-2分钟。14000-16000Xg离心2-5分钟取出。立刻将收集管放置于冰上，收集管内上清为植物总蛋白，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。不同种类的组织一般产量为2-6mg/ml

三、应用

用于苦荞蛋白的提取及活性研究：

苦荞富含蛋白、黄酮等多种营养成分。根据溶解性的不同,可将苦荞麦蛋白质分为水溶性、盐溶性、醇溶性和碱（酸）溶性四种蛋白,其中不同蛋白组分含量和功能活性有差异。目前,对苦荞麦蛋白的研究主要集中在苦荞总蛋白的提取方法和功能活性方面,为提高苦荞保健价值,更合理利用苦荞各蛋白质组分的活性。本课题主要开展了苦荞清蛋白和球蛋白的提取工艺和功能活性研究,优化苦荞清蛋白和球蛋白的提取工艺,研究两种蛋白的活性作用,选择清蛋白进一步分离纯化,找出抗氧化活性成分。研究其促进植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌的生长情况。

主要结论如下:（1）采用Osborne分级法提取苦荞麦4种蛋白,通过考马斯亮蓝法测得各蛋白组分分别为:清蛋白35.08±0.47%、球蛋白5.23±0.08%、醇蛋白1.17±0.05%、谷蛋白24.63±0.54%,其中清蛋白含量最高。响应面优化提取苦荞清蛋白,清蛋白的最佳提取工艺条件为:料液比1:20 g/m L,提取时间60 min,提取温度35,在此条件下蛋白提取率为35.86±0.89%。响应面优化提取苦荞球蛋白,球蛋白的最佳提取工艺条件为:盐浓度1.00%、料液比1:13 g/m L,提取时间90 min,提取温度50,在此条件下蛋白提取率为5.60±0.26%。

（2）清蛋白和球蛋白均有抗氧化活性作用:蛋白浓度为0.5 mg/m L时,清蛋白和球蛋白对DPPH?清除率分别为77.74%、86.21%;对ABTS+?清除率分别为92.48%、97.36%;蛋白浓度为1 mg/m L时对?OH清除率分别为79.81%、60.82%;蛋白浓度为1.2 mg/m L时,清蛋白和球蛋白的铁还原力分别为OD700=0.604、0.739。进一步对清蛋白进行葡聚糖凝胶G-75初步分离纯化,SDS-PAGE凝胶电泳测定清蛋白抗氧化活性蛋白分子量分布在35～48 k Da区间。

（3）苦荞清蛋白对乳杆菌的生长有促进作用,蛋白浓度为1 mg/m L时促进效果最好。通过测定吸光值,植物乳杆菌吸光值比对照组提高了7.93%、副干酪乳杆菌提高了7.25%、保加利亚乳杆菌提高了10.87%。清蛋白为1 mg/m L时,p H值比对照组略低,说明实验组比对照组产酸能力略强。苦荞清蛋白浓度添加为1 mg/m L,培养至终点时,植物乳杆菌为2.4×109cfu/m L,副干酪乳杆菌为1.23×108cfu/m L,保加利亚乳杆菌6.9×108cfu/m L,均比对照组高。