人硫氧化还原蛋白(TRX)ELISA KIT的应用！

一、背景

人硫氧化还原蛋白(TRX)ELISA KIT用于测定人血清，血浆及相关液体样本中硫氧化还原蛋白（Trx）含量。

二、实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人硫氧化还原蛋白（Trx）水平。用纯化的人硫氧化还原蛋白（Trx）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入硫氧化还原蛋白（Trx），再与HRP标记的Trx抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的硫氧化还原蛋白（Trx）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人硫氧化还原蛋白（Trx）浓度。

三、标本要求

1、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。

2、不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

四、操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2、弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37反应60分钟。

3、温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4、每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37反应60分钟。

5、温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6、依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7、依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8、用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

五、应用

用于重组人硫氧还蛋白1 cDNA的克隆、表达、多克隆抗体制备以及对内毒素血症新生大鼠保护作用的初步研究：

制备重组人硫氧还蛋白1（recombinant human thioredoxin-1,rhTrx-1）,用此蛋白免疫动物制备抗血清,并对抗血清的效价和特异性进行检测,验证其可用性。通过建立新生大鼠内毒素血症模型并予以rhTrx-1进行干预,初步探讨该重组蛋白是否对内毒素新生大鼠具有保护作用,为后期的实验奠定基础。

方法：

1、rhTrx-1cDNA的获取及引物设计：从人胎肝细胞中提取总RNA,反转录成cDNA。从人的cDNA文库中筛选出hTrx-1基因,根据其编码序列,利用DNA Club软件设计上下游引物。应用设计的特异引物,利用高保真的DNA聚合酶进行扩增,PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2、重组原核表达载体的构建以及鉴定：PCR鉴定回收产物和PET-28a（+）载体分别用SalI和SacI双酶切、回收、连接后转入大肠埃希菌DH5a感受态细胞,卡那霉素筛选阳性克降,提取的重组质粒进行酶切和测序鉴定。

3、重组蛋白的诱导表达：提取PET-28a（+）-hTrx-1重组质粒转化入大肠埃希菌BL21工程菌,卡那霉素筛选阳性克降,挑取单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中,振荡培养过夜并加入IPTG至浓度1mmol/1诱导,离心收集菌体沉淀,处理样品后取上清进行SDS-PAGE电泳分析。

4、重组蛋白的大量诱导和纯化：根据上述的诱导表达方法确定最适宜的诱导时间,然后对阳性克隆进行大量的诱导表达,离心收集菌体,1×结合Buffer重悬后4过夜,次日解冻后于冰上超声裂解后,分别取沉淀和上清样品处理后行SDS-PAGE蛋白电泳判断重组蛋白的可溶性。蛋白在上清表达,去内毒素后参照His柱蛋白纯化说明书进行纯化,目的蛋白透析后,Bradford法进行蛋白浓度测定,并于-80保存备用。

5、多克隆抗体的制备与鉴定：初次免疫时,将200μg蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混合,于大鼠皮下多点免疫。随后每隔2周,用100pμg蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合,进行多点加强免疫,同时设立对照组及阴性对照组。每次免疫前及末次免疫两周后大鼠尾部采血,间接ELISA法检测抗血清效价。制备纯化的rhTrx-1多克隆抗体后以Western blot方法检测其可用性以及特异性。

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