大鼠垂体瘤细胞的培养步骤与处理方法及应用！

一、背景

大鼠垂体瘤细胞源自大鼠垂体瘤，分泌泌乳素；表达功能性多巴胺受体。该细胞在免疫抑制的小鼠中不能成瘤，但在半固体培养基中可形成克隆。

大鼠垂体瘤细胞是由Tashjian·A·H等人于1965年7月从一只7月龄的雌性Wistar-Furth大鼠的垂体肿瘤中分离建立的。GH3细胞不是直接来源于GH1细胞的克隆，而是从原代培养的GH1细胞在大鼠身上传代两次形成的肿瘤中建立的。上皮细胞样的GH3细胞比GH1细胞分泌更高水平的生长激素，也可产生催乳素。对调控GH3细胞分泌蛋白类激素的研究表明，氢化可的松可以刺激GH3细胞生长激素的分泌、抑制催乳素的产生。

二、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备F12K培养基；优质胎牛血清，2.5%；HS，15%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）传代方法：1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，收到细胞后传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

三、应用

用于RNA干扰沉默PTTG基因对大鼠垂体瘤细胞增殖与凋亡水平的影响研究：

通过设计能够在垂体瘤细胞中稳定高效表达的PTTG-shRNA慢病毒重组载体,研究该重组载体对于垂体瘤细胞中PTTG的干扰效果,并进一步明确干扰前后,垂体瘤细胞的生长周期与凋亡水平变化,以期探讨PTTG是否可成为未来进行垂体瘤基因治疗研究的有效靶点。

目的基因RNA干扰慢病毒载体制备与RNA干扰有效靶点筛选本实验运用公众网站设计软件,针对目的基因rPTTG靶基因序列,设计四组shRNA干扰靶点序列,分别标记为1#,2#,3#,4#,并构建成为vshRNA重组载体,将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞,对长出的克隆先进行PCR鉴定,然后进行测序比对。

结果显示，四组shRNA重组载体被成功构建,测序无误。制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。