HUH-6人肝母细胞瘤细胞的复苏操作要点及应用！

一、背景

HUH-6人肝母细胞瘤细胞是上皮细胞样贴壁细胞肝癌细胞，HuH-6细胞可产球蛋白和甲胎蛋白。生长培养基：DMEM＋10S＋1%P/S，培养条件 气相：空气95%；CO25%温度：37。

二、复苏操作要点

1）将培养基在37水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。

2）将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过zui易受损的温度段（-5~0）。注意冻存管管口不能没入水中，BIU-87(人膀胱癌细胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。

4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。

5）将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。

6）第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合

三、应用

用于PI3K-Akt信号通路在肝母细胞瘤的作用及肝母细胞瘤预后危险因素的评估研究；

通过差异基因表达筛查发现PI3K-Akt通路的相关因子包括PI3K,Akt,PKC,PKB及GSK-3等在肿瘤组织中特异性的高表达。

利用MTT法测定LY294002作用前后肝母细胞瘤细胞系HuH-6和HepG2的增殖；通过Western blot分析PI3K通路抑制剂LY294002对肝母细胞瘤细胞系中PI3K、Akt表达的影响；RT-PCR检测PI3KmRNA在肿瘤和癌旁组织的表达差异；Western blot检测PI3K、p-Akt（Ser473）以及总的Akt蛋白在肿瘤和癌旁组织的差异。

结果：本研究中,发现HuH-6和HepG2细胞对不同浓度的PI3K抑制剂LY294002处理具有剂量依懒性增殖抑制；

同时,随着PI3K通路抑制剂LY294002浓度的增加,PI3K、p-Akt（Ser473）蛋白在HuH-6和HepG2细胞中的表达逐渐下降,且各组之间的差异存在统计学差异（p<0.001）；

PI3K mRNA在肿瘤组织中的表达显著高于癌旁组织；PI3K和p-Akt（Ser473）蛋白在肿瘤组织的表达显著高于癌旁组织。而总的Akt和β-actin在两组病人中无显著差别。

结论：PI3K-Akt通路的激活可致使肝母细胞瘤肿瘤细胞增殖,相关基因在肿瘤组织的表达显著高于癌旁组织,提示PI3K-Akt通路在肝母细胞瘤的发生发展中起到了重要的作用。