猪免疫球蛋白M(IGM)ELISA KIT的应用！

一、背景

猪免疫球蛋白M(IGM)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中猪免疫球蛋白M(IgM)水平。

实验原理：用纯化的猪免疫球蛋白M(IgM)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入免疫球蛋白M(IgM)，再与HRP标记的免疫球蛋白M(IgM)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的免疫球蛋白M(IgM)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中猪免疫球蛋白M(IgM)浓度。

二、操作流程

1、使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2、根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3、加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育1小时。

4、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5、每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37温育30分钟。

6、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7、每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37温育10分钟。避免光照。

8、取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9、在450nm波长处测定各孔的OD值。

三、应用

用于免疫球蛋白M在鼻咽癌中的表达及其与放疗敏感性的关系研究：

通过检测鼻咽癌组织中Ig M与gp96的表达情况,分析两者表达与NPC患者放疗敏感性的关系,探讨Ig M在NPC组织中表达对NPC放射治疗的作用和临床意义。方法:选取临床资料完整的NPC患者,根据放疗后3个月复查增强核磁共振（nuclear magnetic resonance,MRI）了解鼻咽部肿块消退情况,按照世界卫生组织（world health organization,WHO）对于实体肿瘤放射治疗敏感性评估标准选取60例NPC放疗前组织标本,其中30例为放疗敏感组,30例为放疗耐受组;并取30例同期鼻咽部慢性炎症作为对照;同期选取放射治疗3-6个月后颈部残留淋巴结转移病灶并行颈部淋巴结清扫者9例。

采用免疫组化链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶连结法（streptavidin-perosidase,SP）检测Ig M和gp96在各标本中的表达情况;由两位病理医师在不知病例资料的情况下使用盲法阅片判断,并在高倍镜（×400）下,随机选取每张切片10个染色良好视野,结合阳性细胞百分数和染色强度对免疫组化的结果进行判定。

应用统计软件SPSS 18.0进行χ2检验,计算Fisher确切概率;Spearman相关性分析,分析Ig M和gp96在鼻咽癌中的表达及与放疗敏感性的关系。

结果：（1）免疫组化结果显示Ig M蛋白在NPC组织及炎性鼻咽黏膜组织中高表达率分别为58.3%（35/60）和30.0%（9/30）,两者比较差异具有统计学意义（χ2=6.425,P<0.05）;gp96蛋白在NPC组织及炎性鼻咽黏膜组织中高表达率分别为65.0%（39/60）和20.0%（6/30）,两者比较差异具有统计学意义（χ2=16.200,P<0.05）;

（2）Ig M蛋白在NPC放疗敏感组和放疗耐受组的高表达率分别为36.7%（11/30）和80.0%（24/30）,两组比较差异有统计学意义（χ2=11.589,P<0.05）,即NPC放疗耐受组中Ig M蛋白高表达率明显高于NPC放疗敏感组;gp96蛋白在NPC放疗敏感组和放疗耐受组的高表达率分别为46.7%（14/30）和83.3%（25/30）,两组比较差异有统计学意义（χ2=8.864,P<0.05）,即NPC放疗耐受组中gp96蛋白高表达率明显高于NPC放疗敏感组;

（3）Ig M和gp96蛋白在NPC组织中的表达呈正相关性（r=0.443,P<0.05）;

（4）Ig M与gp96蛋白在NPC放疗后颈部残留淋巴结转移肿瘤组织中的高表达率分别为88.9%（8/9）和77.8%（7/9）;

（5）Ig M蛋白在T1-2期NPC患者的高表达率为26.3%（5/19）,T3-4期高表达率为73.2%（30/41）,两者比较差异具有统计学意义（χ2=11.727,P<0.05）;临床分期-期及-期患者Ig M蛋白高表达率分别为29.2%（7/24）和77.8%（28/36）,其差异比较具有统计学意义（χ2=11.055,P<0.05）,而Ig M蛋白表达在不同性别、年龄、病理类型、分化类型及有无淋巴转移组间比较差异无统计学意义（P均>0.05）;gp96蛋白在临床分期-期及-期患者中的高表达率分别为41.7%（10/24）和80.6%（29/36）,其差异具有统计学意义（χ2=9.573,P<0.05）,NPC患者gp96蛋白表达在不同性别、年龄、病理类型、分化类型、TNM分期组间比较差异无统计学意义（P均>0.05）;

（6）NPC患者的组织类型、分化类型、T分期、淋巴转移及临床分期与NPC的放疗敏感性密切相关（P均<0.05）,而NPC患者性别及年龄与放疗敏感性无明显相关性（P均>0.05）。