GBC-SD人胆囊癌细胞的应用与操作步骤！

一、背景

GBC-SD人胆囊癌细胞是由王展明等人在2000年从一位61岁的男性低分化胆囊癌患者中建立的；GBC-SD细胞的形状有多边形、纺锤形和正方形；GBC-SD细胞能分泌CEA和CA19-9。GBC-SD细胞倍增时间大约为21.4小时，可移植到裸鼠，生成的肿瘤与原发肿瘤相似。

二、使用操作

取出25cm2培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37，5%CO2细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。

1、细胞传代：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）弃上清，沉淀细胞用12ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，然后放入37，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）待细胞完全贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。

2、细胞冻存：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）用适量的冻存液（FBS：DMSO=9：1）重悬细胞，并放置于冻存管中；

4）先将细胞冻存管放置于-201.5h，然后将其移入-80过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放入-80。

3、细胞复苏：

1）从液氮中取出细胞冻存管（注意：佩戴防爆管面具），快速将其置入37水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；

2）将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种25cm2培养瓶，于37，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

三、应用

用于GSP诱导胆囊癌细胞系GBC-SD凋亡、体内外逆转胆囊癌细胞系GBC-SD耐药机制的实验研究：

采用胆囊癌细胞系GBC-SD为研究对象，从形态学、分子生物学、流式细胞学等各个方面研究葡萄籽多酚对胆囊癌细胞系GBC-SD生长抑制及诱导凋亡的作用，并对其作用机制进行初步探讨。

方法：葡萄籽多酚与胆囊癌细胞系GBC-SD作用后，MTT法检测不同浓度葡萄籽多酚对GBC-SD细胞的生长抑制率，瑞士-姬姆萨染色观察GSP处理后GBC-SD凋亡细胞形态，透射电镜观察凋亡细胞超微结构，凝胶电泳检测DNA Ladder，流式细胞仪检测细胞凋亡率及葡萄籽多酚处理后GBC-SD细胞Bcl-2、P53蛋白表达。结果GSP可抑制GBC-SD细胞的生长，其作用随药物浓度提高和作用时间延长而增强，呈现一定的剂量、时间依赖性。

GSP作用后72h，GBC-SD细胞凋亡最明显，瑞士-姬姆萨染色及透射电镜观察核染色质浓缩成斑块，沿核膜收缩形成新月体状，有的裂解为数个致密体，形成凋亡小体。FCM检测发现3μg／ml、6μg／ml、12μg／ml、24μg／ml不同浓度的GSP作用后72h，GBC-SD细胞凋亡率分别为8.01±0.08％、13.27±0.12％、22.07±0.23％、36.59±0.37％，对照组GBC-SD细胞凋亡率为0.23±0.02％。