大鼠晶状体上皮细胞的应用与操作方法！

一、背景

大鼠晶状体上皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来；细胞经BFSP2免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

大鼠晶状体上皮细胞分离自晶状体组织；晶状体源自胚胎发育外胚层，仅含有上皮细胞及其产物，晶状体囊膜作为屏障将晶状体与其它类型细胞完全分开；因而，晶状体上皮细胞培养既无神经和血管组织的干扰，又不受其它类型细胞如成纤维细胞的污染，保证了培养中细胞成分的单一性。

晶状体上皮细胞主要负责调节晶状体的生理平衡，包括电解质和液体的输送。在正常的发育过程中，晶状体上皮细胞分化和成熟，然后迁移到晶状体内部，产生晶体蛋白，自身也拉长而变成晶状体纤维细胞，并最终失去细胞核和其它的细胞器。研究表明，晶状体上皮细胞的分化和极化受到了眼部液体中的生长因子的调控，包括表皮生长因子和胰岛素等。

细胞贴壁后为扁平不规则多角形，呈单层生长、连成膜状。晶状体上皮细胞是紧密贴附于晶状体前囊内表面的单层上皮细胞，其异常增殖和分化与白内障和后囊混浊的发生密切相关，体外培养是研究其生长规律的主要手段。

二、操作方法

1、取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

2、待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。

3、细胞传代

1)吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2)添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37温浴1min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；

3)用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，放入37，5%CO2细胞培养箱中培养；

4)待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

三、应用

用于槲皮素对糖尿病大鼠晶状体上皮细胞凋亡的影响研究：

通过观察槲皮素（QUE）对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病性白内障大鼠晶状体上皮细胞（LECs）凋亡及其凋亡调控基因bcl-2、bax表达的影响,探讨槲皮素对糖尿病大鼠晶状体的保护作用。

方法：

1、体重150g-180g雄性SD大鼠60只,经裂隙灯显微镜检查排除双眼晶状体病变及其它眼部疾病。适应性喂养7d后禁食12h,不禁饮,随机抽取40只予以腹腔注射1%链脲佐菌素,剩余20只大鼠则设置为正常对照组（对照组）,腹腔注射等体积0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液。72h后尾静脉取血,测得空腹血糖≥16.7mmol/L为造模成功。

2、将糖尿病大鼠随机分为糖尿病模型组（糖尿病组）和槲皮素干预组（槲皮素组）。自造模成功第二天起,槲皮素组每日给予槲皮素50mg/kg灌胃,糖尿病组和对照组每天给予等体积0.5%羧甲基纤维素（CMC）灌胃。实验过程中对大鼠饮食、饮水、尿量、精神等一般情况进行每日观察及记录,每周称量体重1次并记录,每2周检测血糖1次。

3、使用复方托吡卡胺滴眼液给以大鼠双眼充分散瞳,采用数码裂隙灯显微镜每周1次对各组晶状体混浊程度进行观察并记录。分别于STZ注射后4周、8周处死各组大鼠5只,12周时处死各组剩余大鼠。摘除眼球,分离晶状体,每组各时间点取5只晶状体用于固定包埋,制备石蜡切片用于HE染色及免疫组织化学法检测晶状体上皮细胞中bcl-2和bax的表达情况。各组剩余晶状体用于制备细胞悬液检测细胞凋亡。