人脂肪间充质干细胞无血清培养基的应用！

一、背景

人脂肪间充质干细胞无血清培养基是一种无异源、无血清、成分确定的培养基；专为骨髓（BM-MSC）、脂肪组织(AT-MSC)、脐带(UC-MSC)等多种来源的人间充质干细胞更好的生长和扩增而设计。

间充质干细胞无血清培养基可在保持人间充质干细胞的自我更新和多向分化潜能的同时进行长期生长培养。

与其他含血清培养基以及其他商业无血清培养基相比，人间充质干细胞在间充质干细胞无血清培养基中表现出更好的增殖和自我更新的潜力；另外，经过长期培养，人间充质干细胞仍能维持其正常的纤维囊状细胞形态，三系分化潜能，并表现正常的hMSC表面标记物和核型稳定。

二、使用步骤

1、人间充质干细胞完全培养基准备

将间充质干细胞无血清生长添加剂(MSCGs)在2-8过夜融化，按1:100比例加入基础培养基中，即成为间充质干细胞完全培养基。

2、人间充质干细胞复苏

从冰箱中取出完全培养基，在生物安全柜或超净台中吸取适量（如T-75瓶：10-15mL)完全培养基沿上表面加入间充质干细胞培养瓶中，切勿冲到细胞培养瓶底面，即：细胞生长面。然后慢慢将细胞培养瓶平放，在37、恒温CO2培养箱中放置5-10分钟后使用。

从液氮中取出冻存的间充质干细胞，迅速将冻存管放入37水浴中，快速融解。

用70%-75%酒精消毒冻存管外壁，在生物安全柜或超净台中打开冻存管，用吸管/移液器将细胞冻存悬液缓慢移入装有5-10mL细胞完全培养基的15mL离心管中（在这一过程请尽可能避免产生气泡）。

1200rpm离心5min，弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数，按密度2×104cells/cm2将细胞接种至步骤中孵育完的细胞培养瓶中，添加细胞时，将细胞培养瓶竖立，细胞悬液直接加到底部，切忌冲到细胞培养瓶底面。

轻轻摇晃细胞培养器皿，使细胞均匀分布，混匀后，置于37、5%CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养。

24h后，更换新鲜的完全培养基（温育至37）。

三、应用

用于脂肪来源的间充质干细胞体外转分化内皮细胞及钙调蛋白拮抗剂W7调控研究：

在无血清培养条件下,将人脂肪来源的间充质干细胞（hADSCs）分化为内皮细胞,为血管组织工程化种子细胞的来源和血管新生模型的建立提供基础。

研究方法：从健康人体抽脂术获得的脂肪进行hADSCs原代培养,用流式细胞术检测CD45、CD44、CD14、CD29及CD105,并分化至成骨和脂肪细胞,以免疫组化方法检测其干细胞的分化能力；然后用含40ng/ml VEGF和lOng/ml bFGF的无血清分化培养基诱导hADSCs分化为内皮细胞,在第15、30、50d通过流式细胞术检测vWF和VE-Cadherin两种特异性抗原表达,并用透射电镜检测WP小体以及成血管实验来检测是否分化为内皮细胞。