铁调素(HEPC)重组蛋白的背景与应用！

一、背景

铁调素(HEPC)重组蛋白是由大肠杆菌原核表达体系表达的重组蛋白。铁调素（Hepcidin，Hepc）是铁代谢的调节因子。Hepcidin通过与位于肠道肠上皮细胞基底外侧表面和网状内皮细胞（巨噬细胞）质膜上的膜铁转运蛋白（ferroportin，FPN）结合来抑制铁离子的转运。Hepc最终分解溶酶体中的转运蛋白，抑制FPN而阻止铁离子的输出，铁离子被隔离在细胞中。

Hepc分子由8个半胱氨酸残基形成含有4个二硫键的单一发夹结构，其氨基酸序列在不同哺乳动物中都高度保守，已发现三种Hepc，分别为Hepc22、Hepc25和Hepc20，后两者是Hepc的主要存在形式，Hepc25存在于人的血液和尿液中，尿中的Hepc22和Hepc20比Hepc25的N端少3个或5个氨基酸，被认为可能是Hepc25的降解产物。CD光谱学特性研究证实，在磷酸缓冲液中Hepc具有两个稳定的β折叠结构，这一结构与抗菌多肽的胱氨酸结构非常相似，属于防御素家族，参与宿主的天然防御。

Hepc作为铁负性调节激素，本身可成为一种降低机体铁水平的外源性药物治疗铁过载疾病。国内外均有学者发现，补充外源性Hepc，对遗传性血色病（hereditaryhemochroma-tosis,HH）、铁相关神经退行性疾病及伴有铁沉积的慢性肝脏疾病等铁代谢相关疾病，都有不同程度的疗效。另外，研制一种Hepc抑制剂或Hepc阻断剂对治疗慢性炎症性贫血等由Hepc长期过度表达所导致的疾病也是非常有用的。

二、应用

用于黄颡鱼Hepcidin调节铁代谢对维氏气单胞菌生长的影响研究：

聚焦于黄颡鱼铁调素基因的功能研究,可为黄颡鱼细菌病防治提供新的思路,相关实验结果如下:

1、利用大肠杆菌原核表达系统成功表达重组黄颡鱼铁调素蛋白rPf Hep（recombinant P.fulvidraco Hepcidin protein）,体外验证rPf Hep具有铁调节活性,能抑制细菌增殖并提高细胞活性。构建黄颡鱼pGEX-KG-Hepcidin重组质粒,转入BL21（DE3）p Lys S感受态细胞成功表达rPf Hep,采用亲和层析法纯化蛋白,SDS-PAGE检测rPf Hep大小为35k Da,Western-Blot检测到目标条带,得到纯度较高的黄颡鱼Hepcidin重组蛋白。将100μM rPf Hep与黄颡鱼原代肝细胞孵育6小时后,肝细胞Hepcidin基因的m RNA水平显著升高,肝细胞内ferritin蛋白含量升高,说明rPf Hep可以促进肝细胞内铁调素下游相关分子表达。

100μM rPf Hep预处理肝细胞6小时后感染A.veronii 3小时,发现rPf Hep组的细菌数量相比对照组少,细菌存活数较高。说明添加rPf Hep限制了A.veronii增殖的可利用铁,保护细胞免受细菌侵害。

2、筛选出Hepcidin的激动剂-盐酸小檗碱（Berberine hydrochloride,BBR）和抑制剂-呋喃硫铵（Fursultime,FSL）,BBR与FSL可以调控铁调素的表达进而对细菌生长产生影响;灌喂rPf Hep和BBR可以提高黄颡鱼对细菌的免疫抵抗力,降低死亡率。

从细胞水平看,50μM BBR处理肝细胞6小时后,Hepcidin的m RNA水平相比对照组显著升高,10μM FSL的处理组Hepcidin m RNA水平相比对照组显著降低。BBR和FSL预处理A.veronii感染的肝细胞,A.veronii增殖水平与Hepcidin m RNA水平的变化趋势相一致。

从个体水平看,灌喂黄颡鱼rPf Hep和BBR24 h后,处理组血清铁含量比对照组低,rPf Hep组肝脏出现明显的铁蓄积。攻毒后第三天,rPf Hep和BBR处理组显著降低了鳃、肝、肠、体肾、脾脏组织载菌量;减轻了鳃、肝组织病理损伤,并且降低黄颡鱼血清铁含量,提高肝脏的铁储存浓度。

统计攻毒后七天的死亡率,发现rPf Hep和BBR降低了黄颡鱼的死亡率;BBR组的相对存活率（relative percentage survival,RPS）达到55.98%。细菌生长过程需要铁的参与,降低细菌的可利用铁含量能抑制细菌的增殖。