大鼠胆固醇侧链裂解酶(CSL)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

大鼠胆固醇侧链裂解酶(CSL)ELISA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）检测样本中胆固醇侧链裂解酶(CSL)的含量。

实验原理：已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

二、大鼠胆固醇侧链裂解酶(CSL)ELISA试剂盒操作步骤

1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育1小时。

4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37温育30分钟。

6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37温育10分钟。避免光照。

8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9）在450nm波长处测定各孔的OD值。

三、应用

用于胆固醇侧链裂解酶Cyp11a1在尼罗罗非鱼中的表达及功能研究：

分离了尼罗罗非鱼及其它脊椎动物的cyp11a1基因,分析了cyp11a1在尼罗罗非鱼成鱼各组织及性腺发育各时期的表达模式和细胞类型,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立罗非鱼cyp11a1突变系,并借助cyp11a1突变模型对皮质激素和性类固醇激素在罗非鱼个体存活和性别分化及配子发生中的作用进行了探讨。

具体研究结果如下：

1)尼罗罗非鱼及其它脊椎动物cyp11a1基因的分离。从尼罗罗非鱼基因组中分离了cyp11a1基因,并以罗非鱼cyp11a1的ORF序列为检索序列,通过blastn从NCBI中分离了人、鸡、中华软骨龟、爪蟾、腔棘鱼、斑点雀鳝、东方鲀、青鳉和斑马鱼等脊椎动物的cyp11a1基因。结果表明,除斑马鱼外,其它脊椎动物均只有1个cyp11a1基因。共线性分析表明,斑马鱼的2个cyp11a基因产生于串接复制而非真骨鱼特有的全基因组复制。

2)cyp11a1在尼罗罗非鱼中的表达。转录组分析及Real-time PCR结果显示cyp11a1主要在成体尼罗罗非鱼精巢、卵巢和头肾组织表达。cyp11a1在孵化后5、7、20、30、40天卵巢的表达水平高于精巢,而在孵化后90、180和300天精巢的表达水平高于卵巢。原位杂交结果显示cyp11a1表达于尼罗罗非鱼精巢Leydig细胞、卵巢鞘膜细胞和间质细胞以及头肾肾间细胞中。

3)尼罗罗非鱼cyp11a1纯合突变系的建立。通过CRISPR/Cas9成功突变罗非鱼cyp11a1并建立纯合突变系。分析发现,cyp11a1纯合突变鱼血清皮质醇含量显著降低,胆固醇含量显著升高。Real-time PCR结果显示,突变鱼垂体中促肾上腺皮质激素合成酶基因pomca的表达显著升高。突变鱼的头肾明显大于对照鱼头肾,且头肾肾间细胞胞质增生。这些结果表明,cyp11a1突变鱼头肾无法正常合成皮质醇。此外,分析发现纯合突变鱼可以存活但抗低氧能力显著下降。这些结果表明,皮质激素对于罗非鱼的压力应激很重要但对于存活不是必需的。

4)cyp11a1纯合突变鱼性腺表型及基因表达分析。采用组织学检测孵化后90天、180天cyp11a1突变XX罗非鱼性腺发现,突变鱼性腺表现为精巢样结构,存在生精细胞。表明cyp11a1突变导致XX罗非鱼发生了由雌向雄的性逆转。对孵化后30天的XX突变鱼性腺进行分析发现,性腺中存在退化的卵母细胞,这表明生殖细胞早期仍然发育为卵母细胞,但无法维持。Real-time PCR结果表明,在孵化后90天突变XX鱼性腺中,雌性特异表达基因foxl2和雌激素合成酶基因cyp19a1a的表达显著降低,雄性特异表达基因dmrt1和雄激素合成酶基因cyp11c1的表达显著升高。

与此一致的是,与对照雌鱼相比,突变鱼血清中E2水平显著降低。添加外源E2可以回救XX突变鱼的性逆转表型,回救的XX突变鱼性腺发育为卵巢,表明雌激素对于罗非鱼雌鱼卵巢分化至关重要。对孵化后90天和180天cyp11a1突变XY雄鱼进行分析发现,突变鱼血清11-KT和T的水平极低,突变鱼性腺具有精巢形态,但精子发生几乎无法进行。添加cyp11a1直接下游产物孕烯醇酮可以升高突变鱼血清中11-KT和T的水平,精子发生恢复。