线粒体分离和线粒体酶提取试剂盒的应用！

一、背景

线粒体分离和线粒体酶提取试剂盒利用专门试剂温和匀浆组织和细胞，再采用差速离心法从匀浆中分离完整线粒体；利用专门试剂，配合超声波破碎线粒体，可以得到保持活性的线粒体酶。

线粒体是半自主性细胞器，不仅是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，为细胞的活动提供能量，而且在许多生命活动中具有重要调控作用。因此，准确和全面分离保持正常活性的线粒体已经成为许多研究的前提。

二、试剂的组成和配制

试剂一：50ml×1瓶，-20保存；试剂二：10ml×1瓶，-20保存；试剂三：10ml×1瓶，-20保存；试剂四：1ml×1支，-20保存；

提取步骤：

1、准确称取约0.1g组织或收集约500万细胞，加入1ml试剂一和10ul试剂四，用冰浴匀浆器或研钵研磨。

2、4600 g离心5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，411000 g离心10min。

4、上清液即胞浆提取物，可用于研究线粒体蛋白向胞浆的释放。

5、沉淀为完整线粒体。含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能。可用于线粒体的生理功能等方面的研究。

6、在沉淀中加入200ul试剂二和2ul试剂四，超声波破碎（冰浴，功率20％或200w，超声3秒，间隔10秒，重复30次），可用于线粒体酶活性测定。

7、在沉淀中加入200ul试剂三和2ul试剂四，超声波破碎（冰浴，功率20％或200w，超声3秒，间隔10秒，重复30次），可用于线粒体蛋白浓度测定。

三、应用

用于卵巢癌紫杉醇耐药细胞系的线粒体蛋白质组学研究：

研究在认识卵巢癌耐药相关基因的基础上,以卵巢上皮癌一线化疗药物紫杉醇耐药细胞系为研究对象,采用反复差速离心法分别提取紫杉醇敏感和耐药细胞系的线粒体,并用电镜和Western Blot法进行鉴定;提取线粒体蛋白,应用胍基化修饰的乙酰化稳定同位素标记、液相色谱—质谱联合制备紫杉醇敏感和耐药细胞系的线粒体蛋白质的表达谱和寻找差异表达蛋白。

方法：

1、紫杉醇耐药细胞系SKOV3-TR、A2780TR耐药性的检测及化疗药物对线粒体膜电位的影响。对卵巢癌敏感细胞系SKOV3、A2780,以及其相应的紫杉醇耐药细胞系SKOV3-TR、A2780TR,培养并用CCK法检测耐药细胞系的耐药指数。运用JC-1染料结合流式细胞技术和荧光电镜技术对上述细胞系进行在不同紫杉醇浓度下线粒体膜电位检测,对不同细胞系的线粒体功能和对紫杉醇作用下线粒体功能的改变进行初探。

2、优化细胞系线粒体蛋白质提取技术。分别采用试剂盒裂解法、经典的差速离心联合非连续密度梯度离心法和反复差速离心法分别提取紫杉醇敏感细胞SKOV3、A2780和其耐药细胞的线粒体,并用电镜和Western Blot法进行鉴定。

3、卵巢癌细胞系SKOV3和A2780的线粒体蛋白质表达谱的制备和卵巢癌紫杉孵化疗敏感与耐药细胞系线粒体的比较蛋白质组分析。首次采用胍基化修饰的乙酰化稳定同位索标记法、液相色谱—傅立叶变换离子回旋共振质谱和定量分析软件MSAQ联用的定量蛋白质组策略制备卵巢癌细胞线粒体蛋白质表达谱,经过比较蛋白质学分析寻找差异表达蛋白。

结果：

1、实验所用紫杉醇耐药的卵巢癌细胞系尚保持良好的耐药性,并且保持原有的细胞形态特点,耐药指数在SKOV3紫杉醇耐药细胞系和A2780紫杉醇耐药系分别为18.34±4.31和5.37±4.26。用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测均可发现在紫杉醇为25μM时可造成线粒体膜电位的改变,但用流式细胞仪定量检测发现:在SKOV3紫杉醇敏感细胞系在药物浓度达到25μM时,线粒体膜电位有显著改变（P＜0.01）,而在此浓度,耐药细胞系线粒体膜电位的改变尚未达到统计学显著性。

2、实验比较了裂解法、经典的差速离心联合非连续密度梯度离心法以及优化的反复差速离心法提取线粒体的效果,并且经电镜观察加以验证。从电镜结果可以看出,试剂盒裂解法线粒体无正常形态,破碎、断裂,仅剩双层膜碎片,线粒体纯度仅在40—50%。比较反复差速离心法和差速离心联合非连续密度梯度离心法,二者均能获得完整的线粒体,纯度可达到70%。比较二者线粒体蛋白的获得率,反复差速离心法用于SKOV3-TR及SKOV3细胞系,获取1mg线粒体蛋白质,需2×108个细胞;用于A2780-TR及A2780细胞系,获取1mg线粒体,约需3—4×108个细胞方。采用反复差速离心联合非连续密度梯度离心法,同样细胞量仅能提到约200—300ug的线粒体,且重复性较反复差速离心法差。