人组胺释放因子(HRF)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

人组胺释放因子(HRF)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人组胺释放因子(HRF)水平。

原理：用纯化的人组胺释放因子(HRF)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人组胺释放因子(HRF)，再与HRP标记的人组胺释放因子(HRF)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人组胺释放因子(HRF)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人组胺释放因子(HRF)浓度。

二、人组胺释放因子(HRF)ELISA试剂盒操作步骤

1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育1小时。

4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37温育30分钟。

6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37温育10分钟。避免光照。

8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9）在450nm波长处测定各孔的OD值。

三、应用

用于关于慢性自发性荨麻疹发病机制的几项血清学检测研究：

通过检测：

（1）慢性自发性荨麻疹患者的血清中组胺释放因子（HRF）及HRF反应性IgE含量，判断两者的血清含量与慢性自发性荨麻疹发病严重程度之间是否存在相关性；

（2）慢性自发性荨麻疹患者血清中是否存在幽门螺杆菌及甲状腺反应性IgE，其在血清中的含量与正常人群相比是否存在差异性；

（3）慢性自发性荨麻疹患者血清中三磷酸肌醇的含量，判断其是否随着病情变化而发生改变。

结果：

1、慢性自发性荨麻疹患者组和正常对照组的血清HRF含量分别为8.81±6.03ng/mL和4.31±2.13ng/mL，两者差异显著（P<0.05），患者组高于正常对照组；荨麻疹活动度评分（urticaria activity score，UAS）高分组的慢性自发性荨麻疹患者血清HRF含量与轻症组之间存在显著差异（11.06±6.33ng/mLvs.4.65±1.81ng/mL，P<0.05），重症组高于轻症组。HRF反应性IgE在慢性自发性荨麻疹患者组和正常对照组的血清含量分别为1.67±0.47IU/mL和0.55±0.41IU/mL，两者差异显著（P<0.05），患者组高于正常对照组；UAS高分组的HRF反应性IgE的含量与UAS低分组存在显著差异（1.30±0.32IU/mLvs.0.91±0.24IU/mL，P<0.05），重症组高于轻症组。经Pearson相关分析显示，慢性自发性荨麻疹患者组血清中HRF及HRF反应性IgE含量存在正相关关系（r=0.431，P=0.006）。HRF可能作为自身抗原参与慢性自发性荨麻疹肥大细胞的活化。

2、慢性自发性荨麻疹患者组和正常对照组血清HP反应性IgE含量平均值分别为0.4423±0.1243IU/mL和0.1432±0.0378IU/mL，患者组发病时血清中HP反应性IgE含量高于正常对照组的血清含量，两组间存在显著差异（P<0.05）。慢性自发性荨麻疹患者组和正常对照组的血清HP反应性IgE阳性率分别为47.1%和17.6%，两者无明显差异（P>0.05）。

3、慢性自发性荨麻疹患者组和正常对照组的血清甲状腺反应性IgE含量平均值分别为0.4780±0.0592IU/mL和0.3802±0.0631IU/mL，两组血清中甲状腺反应性IgE含量无明显差异（P>0.05）。两组血清中甲状腺反应性IgE与正常对照组的阳性率分别为70%和40%，两者差异显著（P<0.05）。

4、慢性自发性荨麻疹患者组在发病高峰期与恢复期的血清中IP3含量分别为：43.54±41.97pg/mL和18.40±17.53pg/mL，慢性自发性荨麻疹患者组血清中IP3在疾病恢复期明显下降，统计学分析显示两组间显著差异（P<0.05）。

结论：血清HRF在慢性自发性荨麻疹患者组含量高于正常对照组，重症组的含量高于轻症组；血清中HRF反应性IgE在慢性自发性荨麻疹患者组含量高于正常对照组，重症组的含量高于轻症组。慢性自发性荨麻疹发病的严重程度越高，组胺释放因子（HRF）及HRF反应性IgE的含量就越高。

HRF与HRF反应性IgE的含量呈线性关系。HRF可能通过与HRF反应性IgE结合发挥作用。慢性自发性荨麻疹患者血清中存在幽门螺杆菌反应性IgE，其含量高于正常对照组，幽门螺杆菌反应性IgE有可能参与慢性自发性荨麻疹肥大细胞的激活。慢性自发性荨麻疹患者血清中三磷酸肌醇在发作高峰期和恢复期的血清含量发生明显变化，发病高峰期的三磷酸肌醇含量在疾病控制后明显降低，说明其在慢性自发性荨麻疹发病中具有重要作用。