DNA磷酸化试剂盒的实验步骤与应用！

一、背景

DNA磷酸化试剂盒能将DNA分子5′端的-OH基团磷酸化，处理后的DNA可以直接用于连接反应、克隆等，不需要纯化。

人工合成的PCR引物、linker和adaptor的5′端一般都是-OH基团而不是-PO4基团（除非额外付费要求在人工合成时加上-PO4基团），而任何DNA连接酶都不能将一个DNA分子5′端的-OH基团和另一个DNA分子3′端的-OH基团进行连接，因此通过人工合成的DNA片段和天然DNA之间的连接效率一般都比天然DNA彼此的连接效率低（天然DNA 4个端口均可连接，人工合成的DNA跟天然DNA有2个端口可以连接，人工合成的DNA之间没有任何端口可以连接），尤其是在平末端连接时。DNA磷酸化试剂盒可以快速把DNA 5′端的-OH基团变成-PO4基团，使人工合成的DNA（包括PCR产物）跟天然DNA一样有高的连接效率。

二、实验步骤

注意：如果是PCR产物，一定要先胶回收，不能使用没经过纯化的PCR反应液，因为其中的残留PCR引物会耗掉大量的激酶，降低PCR产物的磷酸化效率。

1、在微量离心管中配制下列反应液（20μL）：

成分用量

PCR胶回收片段2μL（不超过10 pmol）

10×TPK缓冲液2μL

ATP溶液（10 mM）5μL

T4多核苷酸激酶（10U/uL）1μL

超纯水到20μL

2、37反应30分钟。

3、70热处理5分钟，灭活酶。

4、可直接用于后续克隆（加入量不要超过总体积的1/5）。

三、应用

用于DNA磷酸化及T4多聚核苷酸激酶的纳米孔单分子检测研究：

以α-溶血素（α-hemolysin,α-HL）蛋白质纳米孔为传感元件,设计使用发夹结构的DNA,实现了DNA磷酸化和T4多聚核苷酸激酶的单分子检测分析。

设计了带有发夹结构的DNA进行磷酸化检测,利用α-HL（WT）7纳米孔探究了四类未磷酸化和磷酸化DNA的特性。发现3’-磷酸化和5’-磷酸化发夹DNA的稳定性远远低于对应的未磷酸化发夹DNA,磷酸化发夹DNA的滞留时间是未磷酸化的十分之一左右。

电压及盐浓度变化实验表明5’端或3’端的磷酸与主链上的磷酸酯之间产生的静电排斥作用降低了双链的稳定性,使得其解链时间降低。随着碱基配对数的增加,5’端折叠的发夹DNA（5’-hp DNA）和3’端折叠的发夹DNA（3’-hp DNA）的log（Duration（ms））数值分别呈线性增加且二者的线性直线逐渐接近。

通过分析发夹DNA与阿霉素（Dox）结合物的信号发现,阿霉素的加入增强了发夹DNA的稳定性,而且由于5’-磷酸化发夹DNA末端的磷酸根基团与Dox之间的相互作用削弱了磷酸根与主链磷酸基团的静电相斥作用,使得磷酸化的发夹DNA与Dox络合物的稳定性的提高更为明显。

因此,利用此体系可以快速检测和分析未磷酸化和磷酸化发夹DNA,并对发夹DNA与药物分子的结合进行研究。相较于其他检测方法,此方法简单、快速、无需放射性标记和纳米孔修饰,该检测方案为检测DNA磷酸化以及分析磷酸化和药物分子对DNA结构的影响提供了新途径。