人Β葡萄糖苷酶ELISA KIT的操作步骤与应用！

一、背景

人Β葡萄糖苷酶(Β-GLUCOSIDASE)ELISA KIT是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法（ELISA）检测样本中Β葡萄糖苷酶(Β-GLUCOSIDASE)的含量。

原理：往预先包被人β葡萄糖苷酶(β-glucosidase)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人β葡萄糖苷酶(β-glucosidase)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

二、操作步骤

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

三、应用

用于不同来源的β-葡萄糖苷酶的克隆、表达及酶学性质分析研究：

β-葡萄糖苷酶,又称p-D-葡萄糖苷水解酶（EC3.2.1.21）,能特异性地催化低聚糖（通常2-6个单糖残基）、烷基和芳香族烃基末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键的水解。p-葡萄糖苷酶是纤维素酶系中的关键限速酶。获得比活高,产量大,热稳定性好的p-葡萄糖苷酶,一直是研究纤维素酶水解纤维素的热点问题。

从耐热子囊菌和嗜热脱氮地芽孢杆菌中克隆到四种β-葡萄糖苷酶基因tabgl、gebgll、gebgl2和gebgl3,并将它们构建到不同的表达载体pRX2和pGEX-2LT上,转化大肠杆菌BL21（DE3）,构建出七种β-葡萄糖苷酶工程菌,且均实现了它们在大肠杆菌中的表达。

通过对工程菌BL21（pGEX-gebgl1）表达纯化出的p-葡萄糖苷酶酶学性质的研究发现,该重组酶的最适温为60--70,最适pH值为7.0。该酶在60下至少能稳定存在4h,在pH5-10的缓冲液中孵育4小时,酶活力仍能维持在90%以上。该酶在880mM的高离子强度下仍能发挥其功能,经纯化后的纯度可达90%。

测活结果显示,工程菌BL21（pGEX-gebgl1）重组表达的β-葡萄糖苷酶在磷酸钾缓冲液中,酶比活力为0.0058IU/mg,当加入柠檬酸缓冲液和10mMAl3+时,酶比活力可达到0.043IU/mg。聚合状态分析发现该酶具有多种寡聚体形式,并对不同寡聚体进行比活力测定,结果显示这些寡聚体均有β-葡萄糖苷酶活性。