通用型粘液蛋白制备试剂盒的应用！

一、背景

通用型粘液蛋白制备试剂盒通过离心柱法可对不同样本中粘蛋白进行高效提取，提取蛋白可直接用于SDS-PAGE,WB，IP，ELISA，酶活性测定和蛋白质组学分析。

粘蛋白是一类高度糖基化的蛋白，它由蛋白和寡糖链两部分组成，且糖链含量一般在50％～80％之间。该类粘蛋白寡糖链主要以O-连接的形式与蛋白骨架上的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)结合，称之为O-糖链。大量研究表明，正常动物小肠黏膜上皮细胞表面黏液层中含有大量粘蛋白，除了具有保护上皮细胞免受物理或化学损伤外，还参与预防多种疾病的发生和发展的功能，如预防囊肿纤维化症(Cystic Fibrosis，CF)、粘液腺癌、炎症性肠炎等。粘蛋白上的O-糖链结构复杂，活性广泛，在小肠细胞间相互作用、信号调控、分子运输等中发挥重要的调控作用，直接影响生物体的生长发育与疾病的预防。

二、操作方法

1、称取20-30mg（冷冻或新鲜）粘液组织，用剪刀将组织剪成1x1mm的小块或者更小一些。将样品放到离心管柱中。

2、离心管柱中加入10-30mg蛋白研磨粉覆盖组织样品，加入100ul裂解液。

3、立刻用塑料研磨棒按住组织扭转研磨2-3min，将剩余的100ul裂解液加入，继续研磨30s-1min。

4、盖上盖子，台式离心机最高转速离心1min，弃掉离心管柱。收集管中的上清就是提取的总蛋白，将其转移到一个新管中。管底的白色沉淀是穿过柱子的蛋白研磨粉，弃掉即可。

三、应用

用于大鲵皮肤粘液糖蛋白的提取纯化及抗肺癌活性研究：

以大鲵皮肤粘液为研究对象,通过碱提取及层析色谱的方法对粘液糖蛋白进行制备,并利用MTT比色法进行体外抗肺癌活性检测。

主要研究结果如下:（1）大鲵皮肤粘液组份分析。通过对大鲵皮肤粘液中糖、脂肪、蛋白质主要成分分析表明,大鲵粘液中总糖含量为3.69%;粗脂肪含量为4.25%,其中含11种脂肪酸,不饱和脂肪酸中以油酸、亚油酸和亚麻酸含量的较高,分别为27.73%、9.80%、9.20%。饱和脂肪酸中以棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸含量较高,分别为21.53%、5.92%、3.61%。总蛋白质含量为86.56%;总氨基酸含量达83.97%,其中含17种氨基酸成分,以谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸及赖氨酸的含量较高,分别为8.31%、7.99%、6.90%、6.53%。除色氨酸因水解未检到,其余7种人体必需氨基酸含量占总氨基酸的33.96%。通过对大鲵粘液中挥发性气体成分分析,共检测出10种挥发性物质,包括二甲基二硫醚（C2H6S2）和8种脂类化合物,二甲基二硫醚为特殊性气味的主要成因。

（2）大鲵粘液糖蛋白的提取分离及纯化。以糖蛋白抗肺癌生物活性为前提,确定了粘液糖蛋白碱提取方法是:以0.4mol/L的Na OH溶液,料液比为1:25,在45下,提取2h;提取液以4000r/min,离心15min,上清液中加入无水乙醇至终浓度为76%,调p H至7.0左右,于4冰箱中静置醇沉8h;离心去除上清液,糖蛋白沉淀用无水乙醇洗涤三次后,真空干燥得大鲵粘液糖蛋白粗品。对粘液糖蛋白粗品用DEAE-52阴离子交换层析纯化,收集出峰样,透析、浓缩后用Sephadex G-100凝胶柱色谱再次纯化,最终得到一种相对较纯的糖蛋白组分。通过SDS-PAGE蛋白电泳检测,该糖蛋白为单一组分,其分子量约为30k Da。