溶源性细菌的检查方法与鉴定步骤！

一、原理

细菌染色体上整合有前噬菌体（或称原噬菌体）并能正常生长繁殖而不被裂解的细菌，称为溶源性细菌。溶源性细菌在自然界中普遍存在，而且自发裂解，释放温和噬菌体，但频率较低（10-2~105）物理方法（如紫外线和高温）和化学方法（如丝裂霉素C）可诱导大部分溶源菌裂解并释放温和噬菌体。溶源性细菌对同一种或关系密切的噬菌体具有免疫性，因此对于溶源菌的检查必须有相应的敏感菌株才能确定，敏感菌株对以从待检的溶源菌株相近的种或变种或不同菌株中找到。

溶源性细菌裂解释放噬菌体，会给发酵工业带来威胁，溶源性细菌使宿主细胞发生溶源转变，不仅可以保护溶源菌免受同源噬菌体的再感染，还会赋予宿主细胞新的特性，温和噬菌体已被广泛用于转导、基因工程载体和分子生物学等领域。本实验采用诱导方法使溶源细菌裂解.再用敏感菌双层平板法检测诱导后噬菌体释放数目的增加，从而确认细菌的溶源性。

二、材料

1、样品 待检菌——大肠杆菌225 (λ),敏感菌——大肠杆菌226。

2、培养基及药品和试剂 LB固体、半固体和液体培养基，1%蛋白胨，100mmol/l Tris-HCL(pH7.6)缓冲液或生理盐水，氯仿，0.2%柠檬酸钠溶液。

3、设备 水浴箱、台式离心机、紫外光灯、摇床等。

4、器皿及其他 试管、培养皿、三角瓶、吸管，离心管、滤膜、滤膜滤菌器等。

三、方法与步骤

本实验采用紫外线处理诱导溶源菌裂解，未经诱导处理的溶源菌菌悬液做对照。

1、溶源菌培养 将经LB斜面活化的大肠杆菌225（λ），接种于装有20mlLB培养液的250ml三角瓶内，30振荡培养16h，再从中取2ml菌悬液接入另装有20ml LB培养液的250ml三角瓶内，37振荡培养2h至对数期。

2、排除游离噬菌体 如待检菌株为芽孢杆菌，可先制成孢子悬液，再经80 10min处理，杀死溶源菌表面可能吸附的及游离的噬菌体；如待检菌抹为非芽孢杆菌，可利用噬菌体制备的抗血清或0.2%柠檬酸钠溶液洗涤对数期溶源菌细胞，除去表面吸附的及游离的噬菌体。然后经4000r/min离心10min，上清液可加人敏感指示菌做双层平板测定，用于检验样品屮足孖钌游离的噬菌体及吸附「溶源菌表曲的噬菌体，离心后的菌体细胞进行诱导处理。

3、诱导溶源菌 离心后收集的菌体用无菌生理盐水洗涤两次，用生理盐水或100mmol/l Tris-HCL缓冲液（pH7.0）制成终浓度为1011个/ml细胞的菌悬液，每皿加5ml菌悬液，经紫外灯30W，距离30cm、照射30s，立即加入5ml双倍浓度的LB培养液，混匀后37黑暗中培养2h。

4、溶源性菌株检查 按双层琼脂法操作，取上述诱导裂解液加入几滴氯仿，以10倍稀释法适当稀释，选择后3个稀释度的稀释液，毎个稀释液取0.3ml与0.2ml对数期敏感大肠杆菌226菌悬液混匀，再加入融化后冷却至45的LB半体培养基，立即混匀，随即倾入LB固体培养基平板上，待凝固后，37培养6h观察。经过培养的平板如果有大量噬菌斑出现就证明被检菌株是溶源菌。