质粒菌株产品扩增流程操作说明书！

　　

微生物菌种查询网：收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。

 

1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必先转化提质粒后使用）

 

收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；

 

取1支100μl感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）

 

加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37培养45min；

 

6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）

 

将平板正向培养1h，再倒置37培养14h。如果要求是30度则培养20h；

 

（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另外不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）

 

挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

 

2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）

 

四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。

 

3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4，保质期7天）

 

穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。

 

4、菌落平板（冰袋运输，存于4，保质期7天）

 

直接挑取单菌落至液体培养基中。

 

5、液体质粒（冰袋运输，存于-20，保质期90天）

 

单独提取的液体质粒收到后可直接使用。

 

6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，保质期90天，请务必先转化提质粒后使用）

 

收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。

 

7、常用抗生素推荐浓度：

 

简称中文名称溶剂储存浓度大肠工作浓度备注

 

Amp氨苄青霉素ddH2O 100mg/ml 100μg/ml 0.22µm过滤除菌

 

Car羧苄青霉素ddH2O 50mg/ml 50μg/ml 0.22µm过滤除菌

 

Kan卡那霉素ddH2O 50mg/ml 50μg/ml 0.22µm过滤除菌

 

Spe壮观霉素ddH2O 50mg/ml 50μg/ml 0.22µm过滤除菌

 

Gen庆大霉素ddH2O 50mg/ml 50μg/ml 0.22µm过滤除菌

 

Apr安普霉素ddH2O 50mg/ml 50μg/ml 0.22µm过滤除菌

 

Zeo博来霉素ddH2O 100mg/ml 100μg/ml 0.22µm过滤除菌，低盐高PH的培养基

 

Blast杀稻瘟菌素ddH2O 10mg/ml 50μg/ml 0.22µm过滤除菌，低盐高PH的培养基

 

Hyg潮霉素ddH2O 50mg/ml 50μg/ml 0.22µm过滤除菌

 

Chl氯霉素无水乙醇50mg/ml 50μg/ml松弛型质粒可以提高到170μg/ml

 

Str链霉素ddH2O 50mg/ml 50μg/ml 0.22µm过滤除菌

 

Tet四环素无水乙醇10mg/ml 10μg/ml培养基不能含镁离子

 

Rif利福平DMSO 50mg/ml 50μg/ml一般用于农杆菌

 

Erm红霉素无水乙醇200mg/ml 600μg/ml大肠杆菌对红霉素不敏感

 

简称中文名称哺乳细胞工作浓度

 

G418遗传霉素100—1000ug/mL

 

Puro嘌呤霉素1-10μg/mL

 

Hyg潮霉素50-500μg/mL

 

Zeo博来霉素50-1000µg/mL

 

Blast杀稻瘟菌素1-50μg/mL