BL21(DE3)感受态细胞的制备方法！

一、概要

大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统，大肠杆菌BL21(DE3)菌株是大肠杆菌表达系统最常用的宿主菌株,因此人们需要1种便捷有效的感受态细胞制备和转化方法。需要便捷有效的感受态细胞制备和转化方法。一步法感受态细胞制备操作方便,只加1种试剂即可,更快捷稳定,转化也更方便,不需要热激。研究大肠杆菌感受态细胞一步法制备对BL21菌株的适用性,并对转化过程中的关键参数进行探索和优化。

二、大肠杆菌BL21菌株一步法感受态细胞的制备

活化大肠杆菌BL21菌株, 从37培养过夜的新鲜LB平板中挑取BL21单菌落, 接种到3 m L LB液体培养基中, 37、200 r/min振荡培养过夜;取1 m L过夜培养菌液接种入100 m L液体LB培养基中, 37、200 r/min振荡培养至D600 nm=0.3~0.5 (约3 h) ;将培养液转移到灭菌的50 m L离心管中, 置冰上10 min;4、6 000 r/min离心5 min, 弃上清;用10 m L预冷的无菌TSS重悬菌体细胞;冰上放置10 min, 分装120μL/管 (在冰上操作) , -70保存备用。

三、大肠杆菌一步法感受态细胞转化

取无菌的1.5 m L离心管, 加入1μL待转化质粒, 5×KCM 10μL, dd H2O 39μL, 置冰上;从-70冰箱中取出大肠杆菌BL21菌株感受态细胞, 立即融化;吸取50μL感受态细胞加入上述离心管中, 轻轻吹吸使之与上述试剂混匀, 冰水浴20 min, 室温放置10 min;加入500μL新鲜液体LB培养基, 于37、150 r/min摇床中, 振荡复苏40~50 min;室温、6 000 r/min离心3 min, 弃部分上清, 留取约200μL, 重悬后涂布抗生素平板, 37过夜培养, 观察平板, 计数转化子数, 并计算转化率。

转化率=感受态细胞转化后形成的菌落数 (CFU) /DNA质量 (ecg) 。

转化所用质粒均采用质粒提取试剂盒并按其说明书要求步骤操作, 提取的质粒样品经适度稀释后, 用琼脂糖凝胶电泳检测, 根据其条带亮度与标准的marker条带比较并估算质粒浓度。

四、结果

该一步法制备的BL21菌株感受态细胞可获得106CFU/μg DNA转化效率,完全能够满足常规转化要求。转化过程中相关参数的最佳条件为冰水浴30 min,室温放置10 min,37、150 r/min振荡复苏40 min。

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