明场显微镜观察到的是白色背景、有色结构的图像。在传统的显微形态观察中，该模式已形成了一系列配套的技术体系，具有结构显示全面、观察条件简便和结果保存性好等优点。在分子原位检测的实验中，反应的显色产物有时可能被背景的杂质干扰，判断显色结果和分子分布的特异性有一定困难。荧光显微术较好地解决了这个问题，基本原理是：用荧光染色剂或荧光基团标记的反应物与标本作用，使待检结构具有特异性荧光发光。荧光显微镜（fluorescence microscope）观察到的影像背景全黑，目标结构发光。一般标本中发荧光的杂质很少，因此保证了检测的特异性。

荧光（fluorescence）是一种受激辐射发光。当特定波长的光照射到某些原子时，光的能量使核周的部分电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道（激发态）；但激发态是不稳定的，电子会从激发态恢复到基态，能量以光的形式释放，产生能量低于（波长长于）原激发光的荧光（下图）。生物医学领域最常用的单纯荧光光色有蓝色、绿色和红色，激发它们的色光分别为紫外光、蓝光和绿光。因此，多数荧光显微镜都至少要配置紫外、蓝、绿3种滤光片。

（荧光产生的原理）

观察荧光发光，须采用落射式照明系统（下图示例）。光路与明场显微镜的投射式照明不同，光源发出的光先穿过物镜反向发出，落射在标本上，激发荧光；标本发出的荧光经过物镜折射放大，按传统的光路通过目镜被观察到。在落射式照明光路中，物镜事实上还充当了聚光器的作用。切片的显微观察，先要用白光按投射式照明，找到目标部位，然后关闭透射光源，开启落射式照明。由于需要用到高能量（小波长）的激发光，荧光显微镜的光源通常为高压汞灯或氙灯。

（荧光显微镜的落射式照明光路示意图；左图为其中一个绿光激发红色荧光的滤片组的光路模式图；右图为荧光显微镜正中剖面的侧视图；滤片转台当前位于光路中的滤片组能透过绿色光，激发产生红色荧光。）

    荧光显微成像虽然解决了背景干扰的问题，但在结构反差、标本保存性等方面尚不能取代明场成像的技术。不过，在检测分子水平的反应结果时，荧光显微镜观察的是点光源，定位精度高于传统的明场成像。