1.做菌种鉴定有哪些方法？

  在做菌种鉴定之前，首先要确定待鉴定的菌种是不是纯种，这也是至关重要的一步 。菌种不纯是不会得到正确的结果的。纯化方法，常用的有两种

菌种鉴定的方法一般有常规鉴定和分子生物学方法：

（1）常规鉴定：菌落形态观察、革兰氏染色、菌毛染色、糖类分解实验、吲哚实验、淀粉水解实验、V-P实验、甲基红实验、柠檬酸盐利用实验、硝酸盐还原实验、接触酶实验等

（2）分子生物学 方法：细菌16SrDNA菌种鉴定：提取DNA，特定引物PCR扩增，PCR产物纯化测序，进化树分析；真菌18S rDNA/ITS菌种鉴定流程也是一样的。

2.菌种鉴定可以鉴定到种吗？

  16s rRNA作为菌种鉴定相似度超过97%一般定义为同一种菌。

  如果是sanger测序获得16s全长的都可以鉴定到种，甚至能区分亚种。有些细菌并不只有1个16s序列，会包含有1-15拷贝的16s序列，所以单一的16s序列鉴定可能会出现偏差。
  利用高通量如454或miseq测序一般由于读长的缘故，通常只有300-500多个碱基被测序，所以在物种鉴定上一般比较可靠的是能分类到属，部分能分类到种。
  根据我们的经验，不同的样品会有大约10-50的菌能分类到种。利用新的分析方法，我们现在也可以利用16srRNA的群落多样性高通测序数据进行亚种级别的分析。主要是利用16s中共同变化的SNP位点进行分型。这样可以大大提高菌种的分类精度，尤其是在有些菌株之间表型差异巨大的时候。

3.文献中未知菌鉴定中有菌落特征的观察，为什么不指明用何种培养基、培养基状态（固、液）及培养条件（时长、温度）？

  不同类型的菌在不同培养基上有显著牲，尤其在显色培养基上，更能一目了然，有辅助判定的作用；但未知菌无法确定在哪种培养基上生长好，以及生长条件等，所以食品安全控制中着重检致病菌，比如检验是否有空肠弯曲菌，有一整套方法，42度，微厌氧条件比较合适，还要增菌；但未知菌不可能把这些条件都尝试一下，我们的方法是全用营养琼脂培养，如果需氧条件下不长，就再实验一下厌氧条件，35度左右培养，时间以长出合适实验的菌为宜.

4.菌种长时间保存后复苏，如何鉴定有没有改变？

(1).仔细观察单菌落的形态结构，比较该单菌落与目的菌单菌落的外在特征，或者查找目的菌特有的生理生化特性，比较现有菌，一般可以作出判断。

(2).如果不能轻易判断，建议对菌株的16sRNA的基因序列进行测序，测序结果与数据库中数据进行比对，建立个系统进化发育树，这样可以精确的判断菌株是否发生改变。

5.微生物的菌种鉴定可以鉴定到“株”一级吗？

  如果菌株是自然界中分离得到，就只能鉴定到种，不能鉴定到株，因为多多少少和其他株系的细菌有区别，即便你做了一些特征的鉴定，发现和某一株细菌一模一样，你也没有理由说你的细菌就是那一株细菌，因为你不可能把所有的特征都做完，株和株之间的关系就相当于不同的人之间的关系，世界上不可能有完全相同的两个人。除非你知道你的细菌本来就是某一株细菌扩增出来的（而且要保证没有变异，否则就是一个新株），可是这样就没必要鉴定了。

6.PCR扩增切胶纯化测序出现套峰是什么情况？

(1)测序结果个别碱基出现N，或者部分连续出现套峰，是由菌种rDNA多态性造成，对菌种鉴定无影响；

(2)所有测序反应均出现大面积套峰，由于客户提供样品模板不纯造成，这种情况需要客户重新纯化菌种或进行TA克隆

7.常规鉴定中，如何判断菌种质量？

(1).肉眼观察：优良菌种菌丝浓白，绒状，粗壮密集，生长整齐，速度快，香味浓厚。

(2).优良菌种标准可归纳为："纯、香、正、壮、润"五个字。检查时，打开瓶塞，从菌种瓶中部取出小块菌丝体，观察色泽，闻其气味，手捏料块检查其含水量，看是否符合上述要求标准。

(3).显微镜检查：挑取少量菌丝，置显微镜上观察其形态，菌丝分枝，分隔情况，锁状联合，细胞膜的厚薄。 培养观察：从菌种瓶中挑取小块菌丝体，接种斜面试管培养基上，置23～25恒温中培养，经五周后检查菌种生活力。如果菌丝生长快，旺盛纯一，健壮浓厚，长且整齐，则表示菌种的生活力强。

(4).分块法：在桌上放一张白纸，把菌龄相同的菌种从瓶内取出一大块，用手分成2块，再把2块分成4块，4块 分成8块，依次进行。优良菌种整块多，碎渣少。劣次菌整块少，碎渣多。

(5).液体菌种鉴别：当三角瓶或发酵缸培养3-7天后，如液面出现气泡，产生"油皮"、混浊等现象，说明菌种本 身带有杂菌。如菌块上浮，或迟迟长出很薄的菌丝层，则说明菌种生活力弱。白块四周的菌丝生长快、浓白、棉絮状，表明菌种生命力强。