原创 文刀同  微生态

N和P通常被认为是控制陆地生态系统生产力和功能的主要限制因素。N的输入在缓解N对生态系统的限制的同时，会导致P的限制。P有效性是土壤氨氧化剂研究较少的环境驱动因子。土壤中的有效P浓度有时被测量以解释氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）的多样性，但在评估这两种营养素对形成氨氧化菌群落的重要性时，独立于N的添加P的操作是罕见的。因为P的加入可以加速N矿化作用，它可以通过增加NH4+的有效性间接刺激硝化菌。此外，土壤中的某些氨氧化类群可能受到P的限制，但缺乏有关这一问题的信息。

尽管N有效性和土壤pH值的变化可能是土壤氨氧化剂对N/P施肥响应的群落多样性的重要驱动因素，但植物群落特征变化的可能作用也应予以考虑。事实上，许多机制可以解释植物多样性对土壤微生物群落的影响。

因此，AOA和AOB多样性对N/P添加的响应可以由土壤环境变量（如pH和NH4+）和植物多样性的变化驱动，但这些不同可能驱动因素的相对重要性仍有待测试。本文揭示了N、P和NP添加对AOA和AOB群落总体组成和丰富度的影响。AOA和AOB的丰富程度能直接对N和P资源的可用性变化作出反应，并与植物物种丰富度有关。

实验设计

1. 场地描述及试验设计

研究区位于青藏高原东部，甘肃省兰州大学高寒草甸湿地生态研究站玛曲试验场。土壤类型为Mattic Cryic寒武系。过去，该地区曾被绵羊和牦牛放牧。实验场地于2011年围起围栏，自2011年起每年5月施肥。

采用三种施肥方式：N肥（NH4NO3）、P肥（Ca(H2PO4)2）和NP肥（NH4NO3和Ca(H2PO4)2）。施N肥量为0、5、10、15 g-N m -2year-1；施P肥量为0、2、4、8 g-P m -2year-1。NP处理相当于10 g-N m -2year-1 NH4NO3与0、2、4、8 g-P m -2year-1（Ca(H2PO4)2）的组合。采用随机完全区组设计，对每一施肥梯度，每施肥水平使用10m *20m区和3个重复。每个地块用1米的缓冲带与其他地块隔开。

土壤样本于2014年8月，从30个地块（10个处理×3个重复）开始施肥。与改变土壤等更直接的影响相比，处理时间被认为足以检测植物多样性可能介导的间接影响。从每个样地中随机抽取4个土芯（直径3.8cm，深度10cm）进行混合，得到一个复合样，进行后续的实验。

2 植物群落和土壤特征

对于每个地块，在50 cm*50 cm样方上测量植物群落。地上部分的植物剪接收集，并对植物种类进行鉴定和分类、测定各树种地上干生物量。在用于植物群落特征的样方附近随机取4个土芯。将土壤混合以获得每个地块的复合样品。共采集了30个复合土样。处理后运回实验室并测定土壤理化性质。

3. 高通量测序和生物信息分析

对所有30个样本的AOA和AOB amoA基因进行高通量测序，引物组分别为Arch amoAF/ArchamoAR和amoA-1F/amoA-2R。在Illumina MiSeq测序平台上进行双端测序（2*300）。

结果

1 AOA和AOB群落组成的变化以及与土壤环境变量的关系

 AOA群落组成在N、P施肥梯度上没有显著变化，而NP施肥对其影响显著且强烈；相比之下，P和NP施肥对AOB群落组成没有显著影响，而N施肥对AOB群落组成有显著影响（表1）。

通过BioEnv和Mental测试分析确定的用于预测AOA和AOB群落组成变化的最佳土壤环境变量组合，如表2所示。土壤AN:AP比值、TN和pH被确定为沿N肥梯度的AOA群落组成的最佳解释变量。P梯度下AOA群落组成与土壤含水量有关，而NP施肥梯度下没有显著性模型来解释AOA群落组成的变化。土壤NH4+和pH值是解释AOB群落沿施N梯度的变化的最佳解释变量，在P梯度下AOB群落与土壤NH4+、有机碳和含水量有关。

表1 Adonis试验结果评价了三种施肥梯度处理对氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)群落结构的影响。显著的效果用粗体表示。

表2 BioEnv和Mental测试分析的结果确定了AOA和AOB的群落结构之间的关系，以及三种施肥梯度下土壤环境变量的最佳组合。沿NP梯度没有显著的AOA模型。SM、OC、NH4+、TN 和AN/AP分别为土壤水分、有机碳、氨氮、总氮和有效N/有效P。

2 amoA序列簇对施肥处理的响应，以及与土壤环境变量的关系

从30个样地的土壤序列中，共获得30个AOA-amoA OTUs和287个AOB-amoA OTUs。16个优势AOA OTUs（>0.1%）全部属于Group 1.1b，平均占AOA群落的99.7%，且被分配到5个cluster（簇）（cluster I to v）。与N0P0相比，cluster I在N10P8时的丰度显著下降。仅P添加（N0P8）与N0P0和N10P0相比，cluster 的丰度显著降低。相比之下，cluster III和 IV的丰度在N10P0中最高，在N0P0中居中，在N0P8和N10P8中最低（图1）。总体而言，AOA的cluster I、II、III和IV的丰度与土壤AP呈负相关，与土壤AN/AP比值呈正相关（表3）。此外，cluster 、的丰度与土壤有机碳呈正相关，cluster 、的丰度与土壤pH呈正相关。

27个优势AOB-amoA OTUs（>0.1%）均属于Nitrosospira属，而且它们大多属于Nitrosospira的cluster 3a、3b和4，在较小程度上属于cluster 0和9。cluster 3a和4的AOB在所有处理中都占优势（>75.5%）。cluster 3b的丰度在N10P0中最高，在N10P8中最低；与其他处理相比，N0P8处理显著降低了cluster 9的丰度，而最普遍的AOB cluster（3a和4）的丰度不受施肥处理的显著影响（图1）。cluster 0和9的丰度均与土壤AP呈负相关；此外，cluster 0的丰度与SOC和AN/AP比值呈正相关。相比之下，cluster 3a和4的丰度与土壤环境变量无关（表3）。

图1 (左)氨氧化古菌群(AOA)和(右)氨氧化细菌群(AOB)的amoA序列拷贝的比较，四种施肥处理的对比：N0P0:不施肥；N10P0：仅高N添加；N0P8：只有高磷；N10P8：高氮和高磷添加。上方短棒是标准错误(n=3)。对于每一个集群，不同字母表示差异显著(p < 0.05)。系统发育树包括不同的簇在补充图S2和S3中给出。

表3 Spearman分析了amoA拷贝数与不同群落和土壤环境变量的相关性。聚类的丰度由测序数据提供的相对丰度和qPCR测定的总丰度计算得到。

3 施肥对AOA、AOB群落多样性指数的影响及其与土壤环境变量的关系

N、P单独施肥对AOA群落多样性指数（Shannon指数、OTU丰富度和evenness）无显著影响；与此相反，P的加入（在N继续加入下）降低了AOA群落多样性的这三个指标（表S3）。Spearman分析表明，AOA群落的这些多样性指数与土壤环境变量之间没有显著关系（表4）。

随着施N量的增加，AOB-OTU丰富度显著降低，而AOB群落的Shannon指数和evenness没有显著变化；在P和NP施肥梯度上，AOB群落的Shannon指数和OTU丰富度均显著降低，而evenness则没有变化（表S3）。AOB群落Shannon指数和OTU丰富度的变化与有效P呈弱负相关，丰富度也与土壤水分呈负相关（表4）。综合考虑所有梯度，AOA-OTU丰富度与土壤pH值无关（数据未显示）。

表4 Spearman分析了AOA和AOB的多样性指数与植物物种丰富度和土壤环境变量之间的相关性。

4 AOA和AOB-OTU丰富度与植物物种丰富度的关系

植物物种丰富度随施肥梯度的增加而降低（表3）。植物物种丰富度与NO3-呈负相关。综合考虑三个梯度，不考虑其他可能驱动因素的影响，AOA-OTU丰富度与植物物种丰富度呈显著正相关（0.04），AOB丰富度与植物物种丰富度呈正相关（0.06）。分别考虑各施肥梯度，AOB丰富度与植株丰富度在N、NP施肥梯度上呈显著正相关，而与P施肥梯度上不呈显著正相关，而AOA丰富度与各施肥处理下的植株丰富度无关（图2）。

图2 氨氧化古细菌群落丰富度的变化，AOA（白色）和氨氧化细菌群落丰富度的变化，AOB（黑色）到植物物种丰富度的变化，为（左）N施肥梯度，P施肥梯度（中）和（右）NP施肥梯度。

5 AOA或AOB群落丰富度、土壤环境变量与植物群落丰富度的总体因果关系

结构方程模型使我们能够在土壤环境变量和植物物种丰富度之间对AOA和AOB-OTU丰富度的可能因果驱动因素进行层次分析。综合考虑这三个梯度，土壤速效磷和NO3-的增加通过降低植物丰富度间接影响了AOA和AOB丰富度，植物丰富度与AOA和AOB丰富度正相关，而AP对AOB丰富度也有直接的负效应（图3）。

图3 结构方程模型的结果确定了AOA和AOB的丰富度与土壤性质和植物丰富度之间的主要关系（来自所有梯度的数据）。

讨论

1 AOA和AOB的多样性分别对NP和N施肥敏感

施N肥3年后，AOA群落的丰富度、均匀度和组成没有受到影响。这可能是由于AOA在低营养浓度下达到最大氨氧化速率的能力，如AOA分离物所示，以及AOA的代谢多功能性，可以作为混合营养体生长。相反，施N改变了AOB的群落组成，显著降低了AOB的丰富度。根据为植物开发的物种丰富度生产力理论，随着N有效性的增加，AOB丰富度降低可以解释。

很少有研究分析草地土壤的AOA和AOB多样性对P的响应，而不是N的添加。P肥处理对AOA丰富度、均匀度和群落组成没有影响。这可以解释为，这些西藏草原土壤中的大多数古细菌，其中大多数是AOA，似乎受到P以外的其他资源的限制。与之相反，P的添加降低了AOB群落丰富度和Shannon指数。持续施P可能导致N矿化增加，从而引发更高的N有效性，并可能对AOB丰富度产生连锁效应（即降低）。

AOA和AOB群落的丰富度和均匀度均随NP梯度的增加而降低。随着N、P添加量的增加，氨氧化剂丰富度降低，这可能与资源竞争结果的生态原则“赢者通吃”相一致。然而，结果表明N和/或P可用性的增加可能不是丰富性的主要、直接驱动因素，特别是AOA。事实上，观察到仅添加N或仅添加P并没有改变AOA丰富度。因此，对AOA来说，更高的P资源水平可能没有好处。

2 植物物种丰富度而非土壤环境变量影响AOA丰富度

沿着N梯度，AOA群落结构主要取决于AN/AP、TN和pH值。土壤pH值的重要性低于其他研究，这可能是因为我们的研究中土壤pH变化很弱（最多从5.10到5.45）。同时，土壤水分也解释了P梯度下AOA总体组成的变化。土壤湿度可能对土壤含氧量产生影响，这可能会影响AOA多样性，因为AOA种群之间氧的Km值不同。更具体地说，在所有处理中，AOA群落丰富度与植物物种丰富度呈显著正相关，而土壤环境变量对AOA丰富度没有额外影响。这可以解释，因为较高的植物丰富度可能与较高的植物功能性状多样性有关。然而，观察到的关系很弱（解释了15%的方差）。

3 植物物种丰富度是AOB丰富度的主要驱动力

本文没有观察到AOB丰富度与土壤NH4+之间的明确关系，这表明土壤NH4+的可利用性不能直接控制AOB的丰富度。这与以往关于施肥的温带森林土壤中AOB丰度变化与NH3有效性相关的报道形成了对比。此外，AOB丰度与土壤pH值无关。这也可能是由于在三个施肥梯度上，土壤的pH值范围不足以影响AOB丰度。

       土壤AP在各梯度上均降低了AOB丰度，而总AOB丰度在低P处理下最高(沿P梯度为N0P2，和N10P2沿着NP梯度)。这说明过高的P输入会对AOB产生负面影响。AOB丰富度与植物物种丰富度呈极显著正相关关系，特别是在N和NP梯度上。许多过程可能解释了植物如何影响土壤氨氧化剂群落的组成和丰富度。例如，不同的植物物种可以改变土壤的性质，例如氮的有效性，O 2和pH，渗出的特定化合物影响土壤有机化合物。在这里，证明了AOB丰富度的主要驱动因素是植物物种丰富度和受精引起的土壤P有效性的变化。令人惊讶的是，土壤矿质N有效性的变化没有直接影响，但通过改变植物物种的丰富度却具有很强的间接影响。

评论

本文描述了AOA和AOB多样性、土壤性质和植物多样性在N、P和NP施肥梯度上的特征，并探索了影响AOA和AOB多样性的最重要的决定因素，特别是利用结构方程模型。这项工作有助于全面了解施肥措施如何同时影响高寒草原生态系统中植物和土壤氨氧化微生物群落的多样性。由于SEM分析是建立在相关性的基础上的，仅能说明可能的影响，因此需要进一步的研究来充分证明这些影响。