原创 宋君  微生态

氮是所有生物的重要组成部分，也是限制我们星球上所有生命体的主要营养成分。目前为止，可自由获得氮的最大库存是大气中的氮气，但是大部分生物是依赖生物可利用的氮形式来生长，比如铵盐和硝酸盐。而这些基质的可利用性是依赖于不同的氮转化反应，这些氮转化反应是由具有多种多样新陈代谢功能的微生物构成的复杂网络而实现的。本综述在目前获得的新研究和新发现的背景下，对当前由微生物引起的氮转化过程进行描述，包括这些微生物构成的氮转化反应，参与氮转化的微生物以及它们的生理和环境功能，也对那些并未发现但可能会发生的反应进行了描述。此外，我们对由氮转化微生物之间的相互作用而构成的复杂网络和其对全球生物化学氮循环的影响进行了讨论。

综述结构

综述内容

1.综述研究背景、研究目的、研究内容概述

氮是所有生物体不可缺少的组成元素，也是合成蛋白质和核酸等关键细胞化合物的必要物质。大气中的氮气是可自由获得氮的最大库存，从生物学上来讲，它具有高度多样的可利用性，然而能够固氮的细菌和古生物菌是很少的。而其他生物体却必须依靠如铵盐和硝酸盐这种性质活泼的氮形式来提供生长，可这些生物可利用的氮在许多环境中是罕见的。这些限制性营养盐的可获得性主要是通过由微生物参与的能够改变氮氧化状态的反应来控制的。由于工业氮肥的高投入量，导致人类活动对生物可利用氮的数量产生了极大的影响，人类生产的50%的食物需要依靠工业氮肥，这种氮肥的使用和豆科植物的种植几乎使向陆地和海洋生态系统中的氮输入量增加了一倍。因此为了预测这种氮输入的后果，人们迫切地需要了解由微生物构成的氮转化的基本机制。

由微生物形成的氮转化的过程通常被描述为由六个有序进行的不同反应过程组成的一个循环。这种观点认为一个氮气分子体首先通过固氮作用变成氨气，氨气经过同化吸收作用而转变成生物有机氮，有机氮再经过氨化作用转变成铵盐，而铵盐再通过硝化作用被氧化成硝酸盐（NH4+→NO2-→NO3-），最终再经反硝化作用被还原为一个氮气分子（NO3-→NO2-→NO →N2O→N2）或者经厌氧氨氧化作用被还原为一个氮气分子（NO2-+ NH4+ → N2）。事实上，在氮循环过程并未达到上述所描述的一个平衡状态，反而是与这六个过程中截然不同的氮通量的大小有关。

过去十年来收集的基因数据揭示了参与氮转化的微生物实际上存在巨大的多种多样的新陈代谢功能。现在人们知道很多微生物可以同时发生固氮和脱氮作用。因此，由于它们代谢的多样性，几乎不可能再根据氮转化过程中经典的六个过程来划分这些微生物。故在本文中，我们将使用转化过程的名字，比如反硝化作用和硝化作用，而避免对微生物进行相应的分类。

根据目前的理解，微生物可通过14个离散型的氧化还原反应改变从-3价态到+5价态的含氮化合物（图1），不过这里不包括有机氮和氨气之间的相互转化作用。氮转化有关的酶经常在不同的微生物中被发现，而且这里包括的很多酶还是最近才被鉴定出来的。在过去的十年里，有四种新的反应被研究学者发现，它们分别是：羟胺氧化为一氧化氮的反应（图1，反应7）；一氧化氮通过歧化作用转变成氮气和氧气的反应（图1，反应9）；联氨的合成反应（图1，反应13）；联氨氧化成氮气的反应（图1，反应12）。另外，许多新的代谢能力也被发现，比如光氧亚硝酸盐氧化和生成硝酸盐的完全氨氧化。许多新型的微生物也被鉴定出来，比如氨氧化古生菌，反硝化真核生物有孔虫和共生异养的固氮蓝藻。

本文中，作者在这些新发现的背景下，对目前由微生物引起的氮转化过程进行理解，并对这些微生物构成的氮转化反应，参与氮转化的微生物以及它们的生理和环境功能进行描述，也对那些并未发现但可能会发生的反应进行了描述。此外，作者对由氮转化微生物之间的相互作用而构成的复杂网络和其对全球生物化学氮循环的影响进行了讨论。

2..氮全球生化循环圈：全球的氮库存、氮转化过程、氮通量

如图1所示，图中灰色方块表示氮储存量，束缚在岩石和沉积物中的最大氮存量是氨（1.8×1010 Tg氮 ），虽然这种束缚氨经侵蚀后可被生物利用，但是它在整个氮循环生化圈中起的作用是很小的，而陆地中可自由获得的氨的储存量是未知的，海洋中的氨的氮储存量被估计为340-3600Tg；全球中可自由获得氮的储存库是大气中的氮气（约为3.9×109Tg氮）,紧接着是有机氮、硝酸盐、一氧化二氮中氮的储存量；而全球的亚硝酸盐和一氧化氮中的氮储存量可以忽略不计。

在这些氮储存库中形成的全球生化的氮循环主要是因为以下六个不同的氮转化过程：同化作用（Assimilation）、氨化作用（ammonification）、硝化作用（nitrification）、反硝化作用（denitrification）、厌氧氨氧化作用(anammox) 和固氮作用（nitrogen fixation）。从可查文献中估计了这些过程中的年度氮通量，并作出了如图1所示的简单的假设，在本图中，作者用每年所含Tg氮来表示在这些主要含氮的物质之间的氮通量，其中绿色、蓝色和红色方块分别代表每年的陆地氮通量、每年的海洋氮通量以及每年人为制造的氮通量。其中最明确的氮通量包括氮的流失和固定，因为它们是重点研究的对象。如图1所示，虽然这些氮通量相对较小，但它却可以调控这些生物可利用氮的可用性，而这些生物可利用氮在很大程度上可以通过生物碳泵来控制大气中二氧化碳的去除。据目前估计，生物固氮量（300Tg氮/年）和人工固氮量（125Tg/年）的总和已经超过了通过厌氧氨氧化和反硝化作用产生的氮气的量（350Tg氮/年）。并不是所有的经一氧化氮还原产生的一氧化二氮都可以进一步的被还原为氮气，而每年从海洋和陆地环境中释放的一氧化二氮的氮通量分别为4Tg和12Tg，虽然与其他氮形式的通量相比，一氧化二氮的氮通量相对较小，但是它对环境影响却很大，因为一氧化二氮是破坏臭氧层的主要气体，而且它还是一个强大的温室气体。

如图1所示，在这些不同的氮转化过程中有着截然不同的氮通量，它们并没有达成一个平衡的氮循环，这和论文及教材中经常描述的一样，而最大的氮通量跟氨气和有机氮的相互转化有关。仅在海洋环境中，每年与氨化作用和氨同化作用有关的氮通量（8800Tg氮/年）比海洋中氮的流失和获得的总和氮通量（约400Tg氮/年）高出了一个数量级。另一个巨大的氮通量（约2000Tg氮/年）跟硝化作用（NH4+→NO2-→NO3-）有关，这也正好可以解释为什么在海洋中氨盐的浓度虽然不高，但是海洋氨氧化古生菌却是最丰富的微生物之一。与硝酸盐同化有关的氮通量和硝化作用的氮通量是一个数量级的，即海洋浮游植物每年可减少约2000Tg的硝酸盐氮。而之相比，异化硝酸盐还原为氨的氮通量可能会比较小。虽然目前还没有可利用的对陆地环境中氮通量进行估计的数据，但是因为陆地植物与海洋植物相比对氮的需求比较低，对于陆地植物来说，平均每固定40个分子的碳才需要1分子的氮，而对于海洋植物来说，平均每固定6.6个分子的碳就需要1分子的氮，所以陆地中与同化作用相关的氮通量大概是海洋中的1/6。所以假设在稳定状态下（即氮的获得和流失相等），作者用海洋中的氮通量除以6来估计陆地环境中硝化作用与氨化作用中的氮通量。

图1.氮全球生化循环圈：全球的氮库存、氮转化过程、氮通量

3.微生物构成的氮化合物的转化

如图2所示微生物携带的酶可以执行14个氧化还原反应，在这些氧化还原反应中主要包括8种不同氧化状态下的无机氮（限制酶的中间产物和它们的氧化还原状态没有显示）。氨气与有机氮的相互转化不涉及氮原子氧化还原状态的改变。其中红色的表示还原反应，蓝色的表示氧化反应，绿色的表示歧化反应和归中反应。接下来是执行各种反应的酶：同化硝酸盐还原酶（NAS、NasA和NirA）；膜结合酶（NAR, narGH）；周质（NAP, napA）异化硝酸还原酶；亚硝酸盐氧化还原酶（NXR, nxrAB）；一氧化氮氧化酶（NOD, hmp）；含血红素（cd1-NIR, nirs）和含铜（Cu-NIR, nirk）的亚硝酸还原酶；依赖红细胞色素（cNOR, cnorB）、依赖对苯二酚（qNOR, norZ）和含铜的依赖对苯二酚（CuANOR）一氧化氮还原酶；依赖NADH细胞色素P450的一氧化氮还原酶（P450NOR, p450nor）；黄铜-二铁一氧化氮还原酶（NORvw, norVW）；混合集群蛋白质酶（HCP, hcp）；羟胺氧化还原酶（HAO, hao）；羟胺氧化酶（HOX, hox）；一氧化二氮还原酶（NOS, nosZ）；一氧化氮歧化酶（NO-D, norZ）；同化亚硝酸盐还原酶（cNIR, nasB和nirB）；周质异化细胞色素C亚硝酸盐还原酶（ccNIR, nrfAH）；ε -羟胺氧化还原酶（εHAO, haoA）；八面体血红素亚硝酸盐还原酶（ONR）；八面体血红素连四硫酸盐还原酶（OTR）；钼-铁（MoFe, nifHDK）、铁-铁（FeFe, anfHGDK）和钒-铁（VFe, vnfHGDK）固氮酶；联氨脱氢酶（HDH, hdh）；联氨合成酶（HZS, hzsCBA）；氨单加氧酶（AMO, amoCAB）；微粒甲烷单加氧酶（pMMO, pmoCAB）；氰酸酯酶（CYN, cynS）;尿素酶（URE, ureABC）。

 图2.微生物构成的氮化合物的转化

4.固氮作用

大气中的氮气是可以自由获得氮的最大库存，但从生物学上讲，只有微生物携带的金属固氮酶可以将氮气固定为氨气。固氮酶普遍分布在细菌和古生菌中，这使它们在生物可利用氮被消耗的环境中有一个非常有利的竞争优势。总共有三种类型的固氮酶：钼-铁（MoFe）、铁-铁（FeFe）和钒-铁（VFe）固氮酶，它们有相似的序列、结构和功能特性，但它们的金属系数不同，而所有的固氮酶都是有两种物质组成（图3a）。anfDGK,vnfDGK 或nifDK 分别在活动中心编码含铁、钒或者钼的固氮酶的催化成分，另外，anfH、vnfH 或 nifH 编码含铁的电子转运蛋白（又称固氮还原酶或铁蛋白）。NifH是用来检测环境中有固氮作用微生物的标记基因。土壤固氮细菌vinelandii 可以编码这三种类型的固氮菌，然而其它微生物，比如海洋固氮菌 Trichodesmium spp .只含有钼铁固氮酶。钒是很少被限制的，但钼和铁分别在陆地和海洋环境中是罕见的，因此钼和铁可以分别在相应的生态系统中限制固氮作用。

在固氮作用中，一个电子载体比如铁氧化还原蛋白会首先会减少铁蛋白，随后会减少催化剂组分，这需要铁和催化蛋白的分离和再结合。每固定一分子的氮分子，需要消耗16分子的ATP。额外的生物能量损耗是由于强大的还原剂如铁氧化还原酶的生产和不稳定含氧固氮酶的保护。由于氧气的暴露会使固氮酶失效，故含氧的光能利用菌，比如Trichodesmiumspp.、Crocosphaera watsonii 和Nodularia spp. 会使固氮作用和光合作用从空间上（比如在专门的固氮异形细胞里）或者时间上分离。而非光和作用的生物体生活在含氧环境中则需要一些机制从氧气中保护它们的固氮酶，比如增加氧气呼吸、超氧化物歧化酶的解毒作用和固氮酶的构象等机制。而关于存在能够用一个不寻常的固氮酶去进行一个完全不同的、对氧气不敏感的固氮途径的观点也在最近被反驳了。

虽然现在用于固氮作用的真核生物还没有被发现，但是许多有固氮作用的微生物都可以和真核生物共生。例如单核蓝藻菌UCYN-A是固氮微生物中最普遍的一种，它与小型的单核海藻共生，并在海洋固氮作用中起着重要的作用。共生固氮微生物也是动物肠道菌群的一部分，比如在白蚁类和双壳类中发现的一些特殊细菌。此外，根瘤菌目的一些固氮成员生活在豆科农作物的根瘤关节处，像苜蓿、黄豆、豌豆和大豆等植物，这些农作物提供了全球20%的食物蛋白。

图3.催化氮循环中关键的四种反应的酶

5.羟胺氧化成一氧化氮以及进一步氧化成亚硝酸盐

氨气向羟胺的有氧氧化是一个吸热反应，因此，所有的氨氧化剂可以使羟胺氧化从而保存能量。而需氧氨氧化细菌用八面体血红素羟胺氧化还原酶（HAO）可以将羟胺氧化成亚硝酸盐。但最近研究表明，HAO将羟胺氧化的结果不是亚硝酸盐，而是一氧化氮，然后一氧化氮在一种未知的酶作用下才会被进一步氧化成亚硝酸盐。尽管目前这种未知的催化酶还没有被最终确定下来，但是含铜的亚硝酸还原酶（Cu-NIR, nirk）却可以在一氧化氮被氧化成亚硝酸盐的相反方向起到催化作用。所有的氨氧化细菌，包括新发现的可以一步使氨气彻底氧化成硝酸盐的消化螺菌属细菌，它们都包含氨单加氧酶（AMO）和羟胺还原酶（HAO），相比之下，已知的氨氧化古生菌却不能编码羟胺还原酶（HAO），而使羟胺氧化反应发生的古生菌酶还是未知的。

八面体血红素羟胺氧化还原酶（HAO）属于八面体血红素蛋白家族，在很多微生物中都可以被发现。厌氧氨氧化细菌的基因可以编码约十种的类似于HAO的蛋白，而其中的一种蛋白也可以使羟胺氧化成一氧化氮。在种厌氧氨氧化细菌中，这种羟胺氧化酶（HOX）可以回收从联氨合成酶中泄漏的羟胺。

甲烷氧化细菌也可以产生羟胺，这是由于它们非特异的氨氧化反应。属于变形菌门、疣微菌门和NC10菌门中的多种多样的甲烷氧化菌可以编码类似HAO的蛋白，而这种蛋白很有可能使羟胺氧化成一氧化氮，一氧化氮还可以进一步被氧化成亚硝酸盐或者被还原成氧化亚氮。目前，在甲烷氧化细菌中发生的这种反应是否可以直接有助于能量保存还未可知。

6.亚硝酸盐向硝酸盐的氧化

亚硝酸盐的氧化是产生硝酸盐的主要生化途径，而这一过程可以通过亚硝酸盐氧化还原酶（NXR）来完成。NXR可以被需氧的亚硝酸盐氧化细菌、不产氧的光能利用菌（比如荚硫菌属的KS1、红假单胞菌属的LQ17）、厌氧氨氧化细菌编码。而需氧的亚硝酸盐细菌在亚硝酸盐氧化还原酶（NXR）的作用下会直接发生亚硝酸盐氧化反应从而来保存能量，但是厌氧亚硝酸细菌却不能做到。此外，厌氧氨氧化细菌会将厌氧亚硝酸氧化反应和碳固定作用结合起来。

亚硝酸氧化细菌具有丰富多样的代谢功能，而且还可以在非亚硝酸盐的基质上生长。的确，消化螺菌属的一些细菌可以将氨气彻底氧化成硝酸盐，当消化螺菌属以硝酸盐为基质进行呼吸作用时，如果在氢气环境中生长会进行有氧呼吸，而在有机酸环境中生长则进行厌氧呼吸。亚硝酸盐氧化还原酶（NXR）跟细菌和古生菌的硝酸盐还原酶也相关，亚硝酸盐氧化细菌在NXR的催化作用下进行硝酸盐还原反应。

亚硝酸盐和氨氧化微生物在农业土壤中可以协同作用将氨基化肥转变成硝酸盐，它们在肥料向河水和地下水中的流失过程中起着关键的作用，而化肥的流失会导致河流、湖泊、海岸水域的水体富营养化。与上述同样的协同作用在污水处理工厂中也会被用做去除氮浓度的第一步处理。在海洋环境中，亚硝酸盐氧化细菌会生产硝酸盐，而硝酸盐是海洋中最主要的生物可利用氮，同时亚硝酸盐氧化细菌也有助于碳的固定。

7.硝酸盐还原为亚硝酸盐的过程

硝酸盐被还原成亚硝酸盐是用来进行呼吸作用的（此过程又被称为异化硝酸盐还原反应），同时也使氮被同化成生物量。硝酸盐被还原为亚硝酸盐的反应都可以由来自三个领域中的微生物来完成，而这些微生物都存在于含有硝酸盐的缺氧环境中，包括土壤、低氧区、海洋沉积物和人类胃肠道中。这些反应可以被膜结合硝酸还原酶（NAR）或者周质的硝酸还原酶（NAP）催化，而且许多生物体，包括副球菌属的反硝化细菌都含有NAR和NAP。NAR在细胞质中还原硝酸盐，并将质子释放到细胞质中（图3c），并通过质子的动能量直接有助于节约能量。相比之下，NAP在细胞外周质中将硝酸盐还原为亚硝酸盐，因此不改变质子位置。

异化的硝酸盐还原为亚硝酸盐不仅仅是反硝化作用的第一步。许多微生物，比如广泛分布在淡水和海洋沉积物中的巨大硫氧化贝日阿托氏菌就是先将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再进一步还原为氨盐。还有许多微生物，比如海洋进化分支SAR11的一些成员只把硝酸盐还原为亚硝酸盐。硝酸盐的还原对于其它氮循环过程来说是亚硝酸盐的一个主要的来源，比如需氧的亚硝酸盐氧化和厌氧氨氧化作用。异化的硝酸盐还原反应还可以与有机物、甲烷、硫化物、氢气或者铁等电子供体的氧化作用相结合。

硝酸盐是真核生物的主要氮源，而细菌和古生菌中都含有同化硝酸盐还原酶（NAS）。考虑到硝酸盐支持了至少20%的海洋藻类的生长，所以在海洋中，硝酸盐的同化吸收作用很可能已经超过了氮循环过程中其它大部分的氧化还原反应。同化硝酸盐还原酶（NAS）与同化亚硝酸盐还原酶共同产生了氨气，而这氨气也成为了生物量的一部分。因为NAS存在于细胞质中，所以硝酸盐的同化需要用依赖ATP的转运蛋白将硝酸盐转运到细胞内。由于这种能量的需求，NAS的活性会在充满氨的环境中被抑制（比如肥沃的土壤中）。

细菌和古生菌的同化硝酸盐还原酶（NAS）、周质的硝酸还原酶（NAP）、膜结合硝酸还原酶（NAR）和亚硝酸盐氧化还原酶（NXR）都属于二甲亚砜还原酶家族，而真核生物的同化硝酸盐还原酶属于亚硫酸盐氧化酶家族，这就表明硝酸盐还原酶有多种起源。同化硝酸盐反应与异化硝酸盐还原反应的途径间的差别并不是绝对的，从原理上讲，亚硝酸盐的产生是由于在呼吸链上可以进一步减少硝酸盐的还原反应，但与之相反的是，分支杆菌结核病已被证实可以用NAS复合体来进行硝酸盐的同化吸收。

8.亚硝酸盐还原为铵盐

亚硝酸盐还原为氨盐的反应可以用做同化作用，也可以用作异化作用。异化亚硝酸盐反应大部分是由嗜热的热球菌属家族的细菌来完成的，这种反应是由nrfAH编码的周质的细胞色素C亚硝酸盐还原酶（ccNIR）、八面体血红素亚硝酸盐还原酶（ONR）或者八面体血红素连四硫酸盐还原酶（OTR）催化完成的，目前尚不清楚后两种酶是否能用于呼吸作用、亚硝酸盐或羟胺的解毒作用中。亚硝酸盐还原为铵盐的过程中还涉及到中间产物羟胺的形成，而羟胺一直和相应的酶结合在一起直到转变成铵盐。

有趣的是，厌氧氨氧化细菌K. stuttgartiensis在缺少产生铵盐的亚硝酸盐还原酶的情况下，还可以将亚硝酸盐还原为铵盐，因此可以推测亚硝酸盐还原为铵盐是由一种类似于HAO的蛋白酶来完成的。最近研究表明，一种羟胺还原酶（HAO）可以被ε-变形菌门（比如弯曲杆菌和鹦鹉螺菌）编码，此酶被称为εHAO，也可以将亚硝酸盐或羟胺还原为铵盐，只不过效率比较低。

异化的亚硝酸盐还原为铵盐的反应是异化硝酸盐还原为铵盐（DNRA）过程中的关键反应。微生物可以利用异化硝酸盐还原为铵盐反应（DNRA）和电子供体的氧化的耦合来生长，比如有机物、二价铁、氢气、硫化物、甲烷等电子供体。但DNRA对环境的重要性还未可知，而且在海洋和湖泊等沉积物中当与硝酸盐有关的电子供体超量时，DNRA反应就更偏爱转向于反硝化作用。