肌红蛋白由含1 条多肽链的珠蛋白和1 个血红素辅基（卟啉环-Fe络合物）构成，是肉品的主要呈色物质。血红素辅基中心卟啉铁价位的改变以及血红素辅基与珠蛋白结合力的变化影响肉色变化。血红素辅基具有亲合性，除了由于血红素辅基卟啉环上的铁原子与珠蛋白肽链上氨基酸形成配位键外，血红素辅基亲水性丙酸基团可以以氢键与邻近珠蛋白上的氨基酸发生相互作用，同时血红素辅基与珠蛋白的亲合力还与肌红蛋白分子存在疏水性的空腔有关，这些结合力能够稳定肌红蛋白结构。但是，肌红蛋白中这些结合力的稳定性受很多因素影响，血红素辅基与珠蛋白配位键的强度与pH值、温度和连接的氨基酸等因素有关。

扬州大学食品科学与工程学院、江苏省农业科学院农产品加工研究所、南京理工大学化工学院、分子与材料计算研究所的朱宏星、王道营、徐为民、孙冲、葛庆丰、周宝晶、刘潇采用紫外-可见光谱、荧光光谱及分子对接技术分析血红素辅基与珠蛋白的相互作用，从而得到二者之间如结合常数、结合位点数、作用力类型以及结合位点等重要信息。通过揭示血红素辅基与珠蛋白的相互作用，为控制肌红蛋白血红素辅基的脱落、稳定肉色、提高肉品品质提供参考。

紫外-可见吸收光谱分析结果

珠蛋白在280 nm波长处有明显的紫外吸收峰，这是由于肽链上的色氨酸和酪氨酸的芳杂环发生了π→π*电子跃迁，随着血红素辅基浓度的提高，珠蛋白紫外吸收峰峰值有增大趋势，说明血红素辅基与珠蛋白发生了相互作用，证明血红素辅基的加入使珠蛋白的微环境发生变化。

圆二色性光谱分析结果

在圆二色性光谱中，珠蛋白溶液在208、222 nm波长处呈现双负峰，190 nm波长附近有1 个正峰，为α-螺旋特征峰。与不添加血红素辅基的珠蛋白溶液相比，添加不同浓度血红素辅基的珠蛋白溶液负峰与正峰的强度均明显增强。加入血红素辅基后的珠蛋白无规卷曲相对含量发生微小变化，α-螺旋相对含量明显升高，β-折叠相对含量明显降低，表明血红素辅基主要通过改变α-螺旋和β-折叠影响珠蛋白的结构，使珠蛋白肽链发生收缩，疏水性增强。上述结果说明，血红素辅基改变了珠蛋白的构象。

血红素辅基对珠蛋白的荧光猝灭机理

在280 nm激发波长下，珠蛋白在335 nm波长处产生最大荧光发射峰。不同温度下（288、298、308 K），随着血红素辅基浓度的提高，荧光峰均逐渐变宽，荧光强度呈规律性降低趋势，最后荧光猝灭程度趋于稳定。以血红素辅基浓度为横坐标，F₀/F为纵坐标，绘制不同温度下珠蛋白的荧光猝灭Stern-Volmer曲线。在288、298、308 K下求得的K_sv分别为4.756×10⁵、4.546×10⁵、4.321×10⁵ L/mol。随着温度的升高，K_sv减小，且3 种温度下，K_q均远大于各类猝灭剂对生物大分子最大扩散碰撞猝灭的速率常数2.0×10¹⁰ L/（mol·s），因此可以判断血红素辅基对珠蛋白作用产生的猝灭现象不是动态猝灭，而主要是形成了复合物的静态猝灭。

血红素辅基与珠蛋白的结合常数和结合位点数

血红素辅基与珠蛋白的结合属于静态猝灭，符合Lineweaver-Burk方程。因此，以lg[Q]为横坐标，以lg[（F₀－F）/F]为纵坐标，绘制不同温度下lg[（F₀－F）/F]-lg[Q]双对数曲线图。通过计算可以求得血红素辅基与珠蛋白作用的结合常数（K_a）和结合位点数（n）。不同温度下，血红素辅基与珠蛋白作用的K_a较大，且变化不大，说明该反应的结合作用较稳定，288、298、308 K下K_a分别为1.497×10⁹、3.818×10⁹、1.327×10¹⁰ L/mol。可以推断血红素辅基与珠蛋白之间存在较高的结合力，3 个温度下的平均结合位点数约为1.87。

血红素辅基与珠蛋白结合作用力类型

由血红素辅基与珠蛋白相互作用的lnK_a-1/T线性方程计算出ΔH=79.46 kJ/mol，ΔS=451.06 J/（mol·K）。ΔG＜0，说明血红素辅基对珠蛋白的反应是自发进行的。其中ΔH＞0、ΔS＞0，推测珠蛋白与血红素辅基结合的主要作用力为疏水相互作用。

血红素辅基与珠蛋白的结合特性

利用AutoDock软件对血红素辅基与珠蛋白所形成复合物的结构进行分子对接研究，选取数目最多、能量最低的构象作为代表性构象，再分析主客体间相互作用情况。血红素辅基结合区域的疏水性口袋由Tyr-103、Lys-42、Ile-99、His-43、Arg-45、His-64、Ile-107、Leu-104、His-97、His-93和Ser-92构成。主客体之间存在疏水相互作用。血红素辅基同His-97、Arg-45、Lys-42、His-93、Ser-92残基间存在氢键作用，键长依次为1.950、2.274、2.434、2.431、2.309、2.400 Å。因此，血红素辅基和珠蛋白之间存在较高的亲合力。通过计算，血红素辅基与珠蛋白的结合自由能为－67.88 kJ/mol。当前选取的优势构象在分子对接模拟结果中的占比达到75%，通过计算结果可以认为，在实际对接过程中该构象是最合理的。

结  论

利用紫外-可见光谱法、荧光光谱法和分子对接技术研究血红素辅基与珠蛋白的相互作用。紫外-可见光谱结果表明，随着血红素辅基浓度的增大，280 nm波长处珠蛋白的特征吸收峰逐渐升高，说明血红素辅基对珠蛋白的二级结构产生了影响；荧光光谱法研究结果表明，血红素辅基与珠蛋白结合生成复合物，产生静态荧光猝灭，求得血红素辅基与珠蛋白的结合常数及结合位点数；同时确定了血红素辅基对珠蛋白的结合作用力主要是疏水相互作用；通过分子对接确定了氢键对维持肌红蛋白空间结构的稳定性也极为重要，特别是对二级结构的形成起关键作用。但这些结合力易受如温度、pH值等因素的影响，从而使肌红蛋白构象发生改变，导致血红素辅基暴露，甚至从肌红蛋白中脱落，造成对肉品品质的不良影响，如肉品色泽劣变、加快脂质氧化等。本研究能够为探索血红素辅基与珠蛋白的相互作用以及更有效地控制肉品品质提供参考。