导语

转化效率定义为转化 1 μg 质粒至给定体积的感受态细胞中所能产生的菌落形成单元(cfu)的数量。但是，转化 1 μg 质粒是不常见的。实际上，转化效率常以在最适条件下转化 100 pg-1 ng 高纯度超螺旋质粒来计算。计算转化效率(TE)的公式为：TE = 菌落数/μg/稀 得最佳实验结果。那么本文介绍能够提高质粒转化效率的方法和技巧。

提高质粒转化效率的方法

高效转化方法

1. 冰上解冻细胞 10 分钟

2. 细胞中加入 1 pg-100 ng 的质粒 DNA(1-5 μl)，混匀，切忌蜗旋

3. 置于冰上 30 分钟

4. 42 热激 10-30 秒或根据推荐条件进行热激

5. 置于冰上 5 分钟

6. 加入 950 μl 室温的 SOC

7. 37 振荡(250 rpm)培养 60 分钟

8. 混匀细胞，切忌蜗旋，并用 SOC 做系列 10 倍稀释

9. 每个稀释比例取 50-100 μl 稀释液涂布于预热的选择平板上，37(SHufflee® 菌株 30)过夜培养或按推荐条件培养

5 分钟转化方法

( 与上述方法相比只有 10% 的转化效率 )

1. 手握解冻细胞

2. 细胞中加入 1 pg-100 ng 的质粒 DNA (1-5 μl)，混匀，切忌蜗旋

3. 置于冰上 2 分钟

4. 42 热激 30 秒或按推荐条件进行热激

5. 置于冰上 2 分钟

6. 加入 950 μl 室温的 SOC。快速取 50-100 μl涂布于选择平板上，37 过夜培养(Shuffle 菌株30)。

注意：使用非氨苄青霉素时，可能需要在涂板前生长一定时间

转化技巧

解冻

• 细胞最好在冰上解冻

• 管中的最后一点冰融化后，立即加入 DNA

• 可以手握解冻细胞，但是一旦温度高于0 时，转化效率就会下降

细胞与 DNA 冰育

• 冰育 30 分钟。预计每缩短 10 分钟会降低转化效率 2 倍

热激

• 温度和时间取决于转化体积和使用的容器，一般为 42 孵育 30 秒

生长

• 37 生长 1 小时对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有最佳效果。预计每缩短 15 分钟会有 2 倍的转化效率损失

• SOC 比 LB 培养基的转化效率高 2 倍

• 振荡或旋转晃动试管可使转化效率提高 2 倍

平板

• 平板可冷可温，可干可湿，对转化效率无明显影响

• 干温的平板更易于涂布，并实现快速菌落形成

DNA

• 用于转化的 DNA 应纯化，并重悬于水中或TE 缓冲液中

• 直接从连接混合物中取 10 μl 的 DNA 用于转化，仅有 2 倍效率损失

• 为实现最佳转化，可通过柱离心或酚/氯仿抽提和乙醇沉淀的方法纯化 DNA

• 最适 DNA 用量比通常认为的要低，纯化超螺旋 pUC19 的用量在 100 pg-1 ng 之间时转化效率最高。但是，随着 DNA 用量增加至100 ng，单次转化反应中得到的总克隆数也会增多