Western Blott用的膜和蛋白质纯化用的柱类似，都是对蛋白进行了吸附，包括胶电转到膜上的蛋白以及封闭所用的奶粉和BSA等都是对膜的一种吸附。这种吸附作用的机理是包括疏水作用、静电、范德华力等等的综合作用，都是非特异性的。封闭时的封闭蛋白不仅是吸附到膜上的空白位置（此点与zzz198506相同），而且还会和膜上已有的蛋白（目标蛋白和杂蛋白）产生竞争性的洗脱作用，而不是和膜上的蛋白产生结合作用。即不是用封闭液封闭杂蛋白的非特异性的抗原决定簇（用抗原决定簇这个词不是很妥当，但好理解一些），而是将杂蛋白从膜上部分洗脱下来，从而减轻了非特异性的条带信号。这种洗脱也会对目标蛋白产生作用，同样减轻其条带信号。

      用吸附-洗脱假说来看封闭的操作，就能明白为什么封闭液的组成、浓度、时间等等要素的对WB的影响。封闭液中要有可以和膜产生非特异性吸附的分子量适中的蛋白，太大了可能对邻近的目标蛋白产生位置阻碍，太小了容易从膜上的孔洞里脱落。封闭液的pH，盐，表面活性剂等一方面影响封闭液中的蛋白与膜的结合吸附，另一方面还会对膜上的已有的蛋白产生不同洗脱作用，这也是WB中选用不同封闭液的原因，即为了尽可能多的洗脱杂蛋白，尽量减少对目标蛋白的洗脱作用。封闭液的浓度越高，封闭时间越长，对膜上孔洞的覆盖越好，由于竞争性的作用，对杂蛋白的洗脱也越好，但对目标蛋白的洗脱也越强。也就是说在相同曝光条件下背景更干净，杂带更淡，但目标条带也更淡。

 

文章来源：南京金益柏生物科技有限公司

 

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