方正银鲫——中华人民共和国国家标准

 Scatterd mirror carp

GB/T 16874 －1997

前    言

    我国东北和西北地区是银鲫的原产地之一。该鱼依其栖息环境不同，而表现为不同的生态类型。尤以黑龙江省方正县双凤水库的银鲫为突出，具有生长快、抗病力强、遗传基础稳定等特点，故称该鱼为“方正银鲫”，现已在我国全面推广养殖。为保证方正银鲫的优良经济性状，防止混杂和退化，特制定该方正银鲫种质标准。

    本标准的附录Ａ至附录Ｄ均为标准的附录。

    本标准从1998年1月1日起实施。

    本标准由中华人民共和国农业部提出。

    本标准由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会归口。

    本标准起草单位：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所。

    本标准主要起草人：刘明华、沈俊宝、范兆廷。

 

 

1  范围

    本标准规定了方正银鲫（Ｃarassius auratus gibelio Bloch）原种主要生物学性状、生化指标、遗传学特性，以及检测方法。适用于方正银鲫良种鉴定。

2  名称与分类

2.1  学名

    银鲫（Ｃarassius auratus gibelio Bloch）。

2.2  分类位置

    属鲤形目（Ｃypriniformes），鲤科（Ｃyprinidae），鲤亚科（Ｃyprininae），鲫属（Ｃarassius），鲫种（Ｃaras-sius auratus）。

3  主要生物学性状

3.1  外部特征

3.1.1  形态性状

    体型短，体侧扁而高，头小，吻钝，口端位，下唇厚，唇后沟仅限于口角。无须。眼小，位于头侧上方。背鳍具有硬刺，外缘平直，后缘锯齿粗，排列稀。胸鳍不达腹鳍。尾鳍分叉浅，上下叶末端尖。鱼体背部、背鳍和臀鳍为黑灰色，体侧深银白色，体侧每个鳞片的边缘颜色稍深。见图1。

3.1.2  可数性状

3.1.2.1  背鳍硬棘Ⅲ（Ⅳ），分枝鳍条数16～19，多数为17。

3.1.2.2  左侧第一鳃弓鳃耙数44～54，多数为49。

3.1.2.3  鳞式：29  32，侧线鳞29～32，多数为30～31。

3.1.3  可量性状

    不同体长组个体，可量性状变动值见表1。

表1

组别 项目	1	2	3	4
全长,mm	42.0～81.0	93.1～118.0	190.0～215.0	206.4～263.2
体长,mm	33.0～66.0	72.0～89.5	161.0～183.0	164.0～199.9
体长/体高	2.48	2.63	2.67	2.35
体长/头长	3.05	3.49	3.73	3.75
体长/尾柄长	6.72	8.39	8.85	7.94
体长/尾柄高	5.92	6.74	6.17	5.96
头长/吻长	3.29	3.68	3.20	3.08
头长/眼径	3.39	3.93	4.72	4.92
头长/眼间距	2.35	2.51	2.17	2.32

3.2  内部特征

3.2.1  鳔

    鳔分两室，前室长为前室1.5倍左右。

3.2.2  肋骨

    肋骨有13对。

3.2.3  下咽齿

    下咽齿1行。齿式为4／4。

3.2.4  脊椎骨

    脊椎骨总数为颅后椎骨、腹椎骨、尾椎骨数之和，脊椎骨总数、颅后椎骨、腹椎骨、尾椎骨数分别为30～31、4、12～13、14块。

3.2.5  腹膜

    腹膜为灰黑色或黑色。

3.2.6  肝脏

    肝脏为灰黑色或黑色。

3.2.7  红血球

    红血球核的长径平均为7.07μm，短径平均为3.84μm，核的体积平均为45.8μm3，

3.3  生长与繁殖

3.3.2  生长

    不同年龄组的鱼体长和体重的实测值见表2。

表2

年龄1)	1	2	3	4	5
体长,mm	41～73	108～141	185～231	233～327	255～336
体重,g	5～25	43～147	190～245	276～850	460～1056
1)  年龄，主要依据鳞片上的年轮数。

3.3.2  繁殖

3.3.2.1  成熟年龄：雌、雄鱼均为1～2龄。

3.3.2.2  雌、雄鱼比为9：1，行天然雌核发育。

3.3.2.3  性腺一年成熟一次，分批产卵。

3.3.2.4  繁殖水温：13～25℃。

3.3.2.5  怀卵量：不同年龄个体怀卵量见表3。

表3

年龄，龄	2	3	4
体重，g	16.0～58.0	50～167	161～410
绝对怀卵量，粒	3362～14531	12752～39858	38600～81127
相对怀卵量，粒／g	101～151	121～165	137～185

4  生化指标

    肝酯酶同工酶（ＥＳＴ）有四种谱型，受a、b、c3个等位基因控制，其中ＢＣ型频率达0.902；另在ＥＳＴ-2位点上a、b、c3个等位基因同时存在于一个个体，即ＡＢＣ异质型，表现出3倍性，见表4、见图2。

表4

样 本 数 , 尾	项目	表  现  型											X2值	概率	基因频率
		AA	BB	CC	DD	AB	AC	AD	BC	BD	CD	三倍性异质谱型			a	b	c	d
61	观察值	0	1	1	0	1	0	0	55	0	0	ABC谱型3	51.2	<0.001	0.033	0.484	0.47	0
	期待值	0.7	14.3	13.8	0	1.9	1.9	0	28.0	0	0

 

5  遗传学特性

5.1  体细胞染色体2倍数

2n＝156～162

5.2  核型

    雌、雄鱼核型完全一致。有中部着丝粒染色体（m组）21对，亚中部着丝粒染色体（sm级）37对，亚端部及端部着丝粒染色体（st组及t组）20对，染色体臂数（ＮＦ）272（见图3）。

 

5.3  脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）含量

体长121～320mm，体重65～1125g健康鱼红血球每个细胞的ＤＮＡ含量为7.69pg（与鸡血对照）。

6  检测方法

6.1  生化遗传分析

6.1.1  肝脏电泳样品液制备

    电泳前，将肝脏从液氮罐中取出，在室温下解冻，然后放研钵中加5倍体积的0.2mol磷酸缓冲液及少量细砂，在冰浴中匀浆，制得的匀浆液用1500r/min离心机离心20min，用上面的澄清液电泳。

6.1.2  电泳方法及染色

    采用7.5%浓度丙烯酰胺凝胶。电极缓冲液和凝胶制备见附录Ａ（标准的附录）。电泳在冰箱中进行，电流为1.25mA，电泳约2h。电泳后取下胶带先置于已配好的萘酯-丙酮液，在37℃温育20min,再加入坚牢蓝液经数分钟染色，可出现红棕色的区带。萘酯-丙酮液与坚牢蓝液的配制见附录Ｂ（标准的附录）。

6.1.3  结果判定

    根据肝酯酶酶谱区带Ⅱ谱带数和迁移距离分出表现型类型，按表现型类型分析得到Ｘ2值、基因频率和表型期待值，详见表4、图2。

6.2  染色体检测

6.2.1  标本制备

    采用肾组织细胞加植物血凝聚素（ＰＨＡ），在25℃条件下培养2～4h，经吹风或者自然干燥制片，吉姆萨（Ｇeimsa）染色。Ｇiensa染色液的配制见附录Ｂ（标准的附录）。

6.2.2  计数

    在光镜下，选取染色体铺散良好，完整的中期分裂相计算染色体数目，确定2n数。

6.2.3  形态分类

    选择10个以上的分裂相，进行显微拍照，按放大照片对染色体组型分析。染色体的形态类别，按以下要求划分：即臂比1.0～1.7为中部着丝粒染色体（m组）；1.71～3.0为亚中部着丝粒染色体（sm组）；3.1～7.0为亚端部着丝粒染色体（st组）；7.1～∞的为端部着丝粒染色体（t组）。m组和sm组染色体臂数为2；st组和t组染色体臂数为1。

6.3  脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）含量测定

6.3.1  血涂片制片

    从尾动脉采血0.5mL，生理盐水（0.7%NaCI）稀释制成血涂片；同时采小公鸡血，用同法制片作对照。

6.3.2  固定

    血涂片空气干燥后，用卡诺氏液（甲醇：冰乙酸，为3：1）固定1h，然后将血涂片移出存放于4℃冰箱中或者直接染色。

6.3.3  染色

    血涂片经3.5mol HCI水解30min（28℃），蒸馏水冲洗，放入希夫（Ｓchiff）试剂[其配制方法见附录Ｃ（标准的附录）]，于28℃暗处染色1h，立即用二氧化硫水洗3～5次，每次2～10min，再经梯度酒精70%、80%、90%、95%、100%脱水，二甲苯透明后用胶封片。

6.3.4  ＤＮＡ含量测定

    用显微分光光度计测量，波长560mm，物镜40×，扫描步距0.5～1μm。

附 录 Ａ

（标准的附录）

电极缓冲液和凝胶的制备

Ａ1  电极缓冲液的制备

    三羟甲基氨基甲烷（Ｔris）6g，甘氨酸28.8g，加少量蒸馏水溶解后，再加蒸馏水至1000mL，用盐酸（ＨＣＩ）pＨ为8.3，使用时稀释10倍。

Ａ2  凝胶的制备

    Ａ液：Ｔris36.3g加四甲基乙二胺（TEMED）0.23mL溶解，加1mol HCI约48mL，再加入蒸馏水至100mL，用盐酸pＨ为8.9。

    Ｂ液：Ｔris3g，加TEMED0.23mL，再加１molＨＣＩ约24mL，再加蒸馏水至100mL，用ＨＣＩpＨ为6.7。

    Ｃ液：丙烯酰胺（ＡＣＲ）20g，甲叉双丙烯酰胺（ＢＩＳ）1g，加蒸馏水至100mL溶解。

    Ｄ液：核黄素（ＶＢ2）0.004g，溶于100mL双蒸馏水。

    Ｅ液：过硫酸铵（ＡＰ）0.28g，加蒸馏水至50mL溶解。

    Ｆ液：蔗糖40g，加蒸馏水至100mL溶解。

    分离胶比例  Ａ液：Ｃ液：蒸馏水：Ｅ液＝1：2：4：1。

    浓缩胶比例  Ｂ液：Ｃ液：Ｆ液：Ｄ液＝1：1：1：1。

附 录 Ｂ

（标准的附录）

染 色 液 配 制

Ｂ1  萘酯-丙酮液

    乙酸-萘酯0.2g，加30mL丙酮溶解。

Ｂ2  坚牢蓝液

    0.2g坚牢蓝染料加200mLpＨ6.4磷酸缓冲液，并使之完全溶解。

附 录 Ｃ

（标准的附录）

吉姆萨（Ｇiemsa）染色液配制

Ｃ1  Ｇiemsa染色母液配制

    称量0.5gＧiemsa粉，量取甘油33mL，在研钵中先用少量甘油与Ｇiemsa粉混合，研磨至无颗粒时再将剩余甘油加入，在56℃条件下保温2h后，加入33mL甲醇，保存于棕色瓶内。

Ｃ2  pＨ7.2酸缓冲液配制

    0.2mol磷酸氢二钠（Ｎa2ＨＰＯ4）溶液72.0mL加上0.2mol磷酸二氢钠（Ｎa2ＨＰＯ4）溶液28.0mL即成。

Ｃ3  Ｇiemsa工作染色液配制

    取100mL pＨ7.2酸缓冲液，加入3mL Ｇiemsa染色母液即成。

 

附 录 Ｄ

（标准的附录）

希夫（Ｓchiff）试剂的配制

    将0.5g碱性品红溶于100mL热蒸馏水中，使之充分溶解，待溶液冷却至50℃时过滤，再冷却到25℃时加入1mol盐酸（ＨＣＩ）10mL和1g亚硫酸氢钠（ＮaＨＳＯ3）或1.5g偏重亚硫酸钠（Ｎa2Ｓ2Ｏ5），放置暗处，静置24h后，加0.25～0.5g活性炭摇荡1min，过滤，溶液呈无色，装入棕色瓶中塞紧瓶塞，保存在冰箱内（0～4℃），用前预先取出，使之恢复至室温后再用。如溶液呈粉红色就不能用，须重配。