抗体的Fab段可能会出现与细胞表面发生低亲和力、非特异性结合的现象，尤其是细胞死亡时或是胞膜受损，这种非特异性结合会更加明显。所以，平时实验中大家经常会用同型对照来确定背景荧光水平。

    我们知道同型对照曾经是流式细胞术中的经典阴性参照，然而要达到同型对照与抗体的交叉反应能力完全一样，就要求亚型、物种、荧光素、荧光素：蛋白质比例、浓度等各方面指标均能达到一致，暂且不提自己是否能够挑选正确，就连厂家都不一定每次能够做到完全一致，所以要找到一个与抗体背景染色完全匹配的同型对照是非常有难度的。

        所以，为了避免大家在设置同型对照时出现一些不必要的误区，我们对同型对照适用情况进行了总结，并归纳出哪些情况下不需要用到同型对照的，以及使用同型对照需要注意的地方。具体事项如下：

1、如果抗原表达情况是为双峰分布，并且阴性峰和阳性峰明显清晰的分开，通过双峰的分布就可以了解实验结果，这时同型对照就不需要设置了。如下图：

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2、如果需要检测的是经过培养的细胞，那么此时设置同型对照，也只能得到一些反映细胞粘附能力的信息，并且很难得到反映其非特异性荧光的信息。故检测培养后的细胞，设置同型对照是不理想的。

3、如果实验中同时用到多种荧光素，进行分析时，发现荧光渗漏对结果影响较明显，而且背景荧光不明显，此时就不宜设置同型对照，在这种情况下FMO对照是最好的选择。（FMO对照是指用同种细胞，染上去掉一种荧光素的其它所有荧光素，这样可以使各种荧光素对未标记通道的渗漏体现出来，使得能够将门放在合适的位置，因此，是设门所必需的对照。而且FMO对照只是在需要准确区分阳性、阴性时才是非常重要的。FMO对照现在已普通应用于多色实验，而且是多色实验所必需的。）

4、在使用同型对照时，发现非特异性结合水平很高，可能是由于非特异性的Fc端和细胞发生结合，就产生了非特异性信号，那么就要注意进行Fc阻断了。

5、要明白同型对照仅仅是参考，帮我们过滤掉一些影响实验的因素，但是不能凭此就判定阳性阴性分界点或以此设门，我们要知道同型对照只能反映非特异性结合的背景荧光，而背景荧光，还会由其它因素引起，例如自发荧光、补偿高、抗体、标记方法、仪器、其它试剂或数据分析等因素都会影响背景荧光。

6、需要进行目标抗体的滴定，以降低非特异性结合的背景荧光，也是不宜设置同型对照的。因为抗体量过多，会造成阴性峰的偏移和基底增宽。如下图：

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7、如果实验中对于细胞信号转导和细胞因子进行检测，不仅要设置FMO对照，还需要设置生物学阴性对照，特别注意未刺激细胞或用磷酸化抑制剂处理的细胞。

8、在多色方案中要加入细胞活性染料，用来除去死细胞。因为死细胞的非特异性染色很强，若是没有除去，会导致较高的非特异性结合，影响实验。

9、除了同型对照，根据不同情况也可以设置其他的对照 。例如对于未染色的细胞，确定背景和自发荧光的阴性对照，设置PMT电压; 完全染色的细胞，确定一些超出坐标轴的事件,设置PMT电压; 单染的细胞/微球，调节补偿; 未刺激或未处理的样本，实验阴性对照；阳性细胞（刺激或特殊药物处理过的），实验阳性对照。

来源：赫贝科技