加载中…细胞冻存的7个注意事项
(2015-08-17 22:00:00)
标签：
细胞培养 |
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一、细胞冻存
方法：
冻存液最好现配：按1：3：6（或1：2：7） 配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态量好的细胞进行冻存处理，
对于贴壁细胞：
1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次
2胰酶消化
3加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止
4离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）
5吸出离心管上清液，加1ML 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放4度半小时，-20 度两小时，-70度过夜，再放液氮长期保存
悬浮细胞：直接离心收集，PBS洗涤
注意事项：
- 错误的时机：
细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已 经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。
解决：
最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。
- 细胞太少：
冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。
解决：
离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。
- 盖子不紧：
冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。
解决：
选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。
- 单薄的冻存盒：
放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。
解决：
选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）
- -80度太久：
放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）
解决：
尽快转入液氮。
- 液氮不足：
液面不能漫过所有细胞。
解决：
定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。
- 取错细胞：
找不到/拿错冻存管。
解决：
每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。
二、细胞复苏：
方法：
- 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
- 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
- 离心， 1000rpm，5min；
- 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
- 次日更换一次培养液，继续培养。
注意事项：
- 取错细胞：
拿错冻存管。（快快快，匆忙之中，难免出错，况且－170多度，冻手！）
解决：
（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。
（2）拿细胞时戴手套！
- 水浴时间太长：
2min还没融化。（冻存管的壁较厚，隔热）
解决：
（1）适当提高水浴温度（37度－40度）。
（2）要是冬天，就选用保温盒。
- 冰盒内时间太长：
复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）
解决： 提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。
- 失去耐心：
复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。（有些细胞复苏后一星期，才有起色）
解决： 不要换液，耐心等待，两周后再做决定。
文章来源：英格恩技术的官方博客，原文详见：http://www.engreen.cn/细胞冻存、复苏的方法及注意事项
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