免疫印迹试验（Western blot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。

众所周知，Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。

Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、 底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。

ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H₂O₂存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）。ECL法具有灵敏度高，线性范围广等特点。

http://s4/mw690/0065FnERzy6UHH4Wu2fd3&690blot发光检测中常见的问题及解决方法" TITLE="Western blot发光检测中常见的问题及解决方法" />

图1 ECL检测原理图

Western blot发光检测受多种因素影响，主要包括：抗原含量，抗体敏感度，底物敏感度，显影和定影效率，等。现根据检测中几种常见的现象问题进行分析：

1.目的蛋白信号弱或无。在Western blot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。曝光时间短也会使蛋白信号降低，因此，要延长胶片的曝光时间。

2.背景较高。 背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题，造成背景深的原因很多。第一，封闭的问题，封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错，但二抗与牛奶可能有交叉反应，因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深，适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色。第三，条带背景深也与曝光时间有关，曝光时间超过半小时出现背景是很正常的，所以可以的话建议曝光1-10min。英格恩公司生产的Westernblot 发光试剂Enlight^TM含独特的发光增强剂和精准的发光底物，比普通发光试剂灵敏度更高、更稳定，而且发光时间长，背景更低。第四，抗原-抗体浓度/HRP过高时，直接或间接结合在膜上，洗脱不掉等原因，考虑降低抗体浓度或蛋白上样量。

http://s1/mw690/0065FnERzy6UHH8o5nqe0&690blot发光检测中常见的问题及解决方法" TITLE="Western blot发光检测中常见的问题及解决方法" />

图2  Western blot发光检测中常见的问题及比较

3.非特异性条带。 非特异性条带与抗体交叉反应有关。单抗比多抗特异性好，纯度高，另外适当稀释一抗/二抗浓度，也是有必要的。如果样本在处理过程中发生降解，则样本处理时加入蛋白抑制剂在冰上操作。

4.显影后膜上条带处变为黄色或为白色。可能是HRP过高导致的敏感性或背景太高，应降低抗体浓度。

5.条带内无显影的白点与转膜和显影的操作有关。转膜前尽量将膜平衡，并注意胶和膜之间避免气泡，显影时膜与X光片间也应避免气泡。

6.散在小圆斑是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致的，解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存，使用时勿混匀，仅用上层。

Western blot发光检测中常见问题及解决办法

底物化学发光ECL是Western blot最常用的显色方法之一，因此，熟悉并掌握其中最常出现的问题及解决办法是做好Western blot发光检测的基础。

文章来源：英格恩技术的官方博客，原文详见：http://www.engreen.cn/western_blot

http://www.engreen.cn/wp-content/uploads/2015/07/%E8%8B%B1%E6%A0%BC%E6%81%A9%E6%8A%80%E6%9C%AF%E7%9A%84%E5%BE%AE%E4%BF%A1.jpgblot发光检测中常见的问题及解决方法" TITLE="Western blot发光检测中常见的问题及解决方法" />