荆芥-防风药对治疗荨麻疹作用机制的网络药理学研究

荨麻疹（Urticaria）是一组异质性疾病[1]，具有肿胀及红斑、瘙痒与灼热感、自发消退3个主要特征[2]。目前，国内外指南和专家共识均推荐第二代抗组胺药物为荨麻疹的一线治疗药物[3]。然而长期服用此类药物副作用较大，易耐受，停药后易复发。中医药在治疗荨麻疹方面具有疗效稳定、不耐受、副作用小的特点，荆芥-防风为中医治疗荨麻疹的常用药对[4]。

中医强调整体观，用药遵循多成分、多靶点、多途径调节的理念。网络药理学可以通过分析多种复杂网络及多水平的相互连接来阐述多成分、多靶点、多通路的潜在作用机制[5]，为复杂中药系统的研究提供思路与方法。本研究拟通过网络药理学方法对荆芥-防风药对治疗荨麻疹的作用机制进行探究，以期为荆芥-防风药对治疗荨麻疹的深入研究提供细胞分子层面的参考。

1 方法

1.1 荆芥、防风化学成分收集 利用中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php），以“荆芥”“防风”为关键词进行检索，收集整理荆芥、防风中所有化学成分。

1.2 活性化合物及靶标蛋白的筛选 借助TCMSP数据平台，根据口服生物利用度（OB）与化合物类药性（DL），设定阈值OB≥30%、DL≥0.18，在荆芥、防风全部化合物中筛选出其活性成分。在Related Targets模块中整理相关活性成分作用靶标蛋白。

1.3 疾病靶点的筛选 通过OMIM（http：//www.omim.org/）、 DigSee（http：//210.107.182.61/geneSearch/）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）等数据库，以“Urticaria”为关键词，检索与荨麻疹相关的基因。

1.4 基因名的转换及化合物-靶点网络的构建 借助UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库查询靶标蛋白对应的基因名，运用Cytoscape 3.7.1软件分析化合物和靶点间的度值，构建活性化合物-靶点网络。

1.5 交集基因的筛选及其蛋白质相互作用网络的构建 为了解荆芥-防风作用靶点和荨麻疹靶点在蛋白水平上的作用机制，将活性化合物靶点与疾病靶点上传至在线韦恩图（Venny 2.1.0，http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）进行分析，得到活性化合物与荨麻疹的交集基因。并将筛选出的核心靶标蛋白导入STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl）在线网站数据库，获取蛋白相互作用关系。

1.6 核心靶点的通路分析 为了进一步探究相关核心基因的功能及其在信号通路中的作用，将选定的荆芥-防风药对治疗荨麻疹的靶基因导入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），对所有靶基因进行官方名称（official gene symbol）校正；设定清单类型为基因列表（Gene List），限定物种为人（Homo sapiens）。进行基因本体（GO）生物学过程富集分析，设定靶点基因富集度＞55%；在Pathways模块中进行基于京都基因与基因百科全书（KEGG）代谢通路富集分析，设定阈值为P＜0.05。将所得数据通过绘图网 站 OmishareTools（http：//www.omicshare.com/tools/Home/Index/index.html）进行结果可视化呈现。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选 从TCMSP数据平台中检索整理得到荆芥、防风化合物共计332个（荆芥159个，防风173个）。以阈值OB≥30%、DL≥0.18从所有化合物中筛选出活性成分共27个（9个来自荆芥，16个来自防风，2个为荆芥、防风的共有成分），相关信息见表1。

2.2 化合物-靶点网络构建 在TCMSP数据库中筛选出荆芥、防风活性化合物27个（其中1个活性化合物未获得作用靶点），整理出化合物作用靶点208个，活性化合物分子与靶点相互作用504次，绘制化合物-靶点相互作用网络，见图1。图中青色节点代表荆芥的活性化合物，绿色代表防风的活性化合物，紫色代表荆芥、防风中共有活性化合物，粉色节点代表活性化合物作用靶点，每条边则表示化合物分子与靶点之间的相互作用关系。在该网络中，54%的化合物作用靶点≥10，平均每个化合物与19.38个靶点相互作用，平均每个靶点与2.42个化合物相互作用。度值表示网络中和节点相连的路线的条数，度值较大的节点在整个网络中起到枢纽的作用，可能是关键的化合物或者靶点。度值排名前5位的化合物分别是MOL000098-槲皮素、MOL000006-木犀草素、MOL000173-汉黄芩素、MOL000358-β-谷甾醇、MOL000449-豆甾醇，分别能与150、57、45、37、31个靶点蛋白发生相互作用。度值排名前5位的靶点是前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、二肽激肽酶 4（DPP4）、凝血因子（F2）、热休克蛋白HSP90α（HSP90AA1）、前列腺素内过氧化物合酶1（PTGS1），分别能与23、15、12、11、11个化合物发生相互作用。

2.3 荆芥-防风与荨麻疹的交集基因 通过数据库获得荆芥活性化合物193个作用靶点，防风活性化合物82个作用靶点，荨麻疹118个相关基因。通过在线韦恩图分析得出荆芥、防风与荨麻疹共有基因6个：RAC-α 丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶（AKT1）、F2、HSP90AA1、白介素 6（IL6）、PTGS2、肿瘤坏死因子（TNF）；荆芥与荨麻疹的共有基因11个：细胞色素 P450 1A1（CYP1A1）、细胞色素 P450 1B1（CYP1B1）、细胞间黏附分子1（ICAM1）、干扰素γ（IFNG）、白介素 10（IL10）、白介素 1β（IL1B）、白介素 2（IL2）、白介素 4（IL4）、E-选择素（SELE）、超氧化物歧化酶 1（SOD1）、血管细胞黏附分子 1（VCAM1）；防风与荨麻疹的共有基因1个：白介素8（IL8）。即荆芥-防风药对活性化合物作用靶点与荨麻疹共有18个交集基因。结果见图2。

2.4 荆芥-防风与荨麻疹的蛋白相互作用网络的构建将18个交集基因数据导入STRING进行分析，构建荆芥-防风与荨麻疹的蛋白相互作用网络，见图3。图中包含节点18个，边110条，每个节点代表不同的蛋白，每条边表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系，线条越粗则关联度越大，平均节点度值为12.2。关键蛋白涉及IL2、IFNG、IL4等。

2.5 靶点通路分析 通过DAVID中的GO功能富集分析获得GO条目16个（靶点基因富集度＞55%），其中生物过程（Biological Process，BP）条目13个，细胞组分（Cellular Component，CC）条目3个，见图4。通过KEGG通路富集分析，筛选获得17条信号通路（P＜0.05），其中涉及同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病、T细胞受体信号通路、Jak-STAT信号通路等，见图5。

3 讨论

根据患病时间，荨麻疹可分为急性荨麻疹与慢性荨麻疹[6]。其中，该病可在短时间内痊愈，称为急性荨麻疹，≥6周内出现风疹或血管水肿称为慢性荨麻疹[7]。Jun ES等[8]统计发现1 027 620人在10年内累计新发荨麻疹率为4.9%，妇女患荨麻疹的比例远高于男性，20～44岁及45～65岁的患者与其他年龄阶段的患者相比，更容易患上荨麻疹。

荨麻疹为皮肤、黏膜小血管扩张及渗透性增加而出现的一种局限性水肿反应[9]。最常见的血管性水肿是由肥大细胞脱颗粒和组胺释放引起，荆芥、防风均有抑制组胺释放的作用。荆芥水提物可显著降低肥大细胞介导的速发型超敏反应大鼠血浆的组胺水平，抑制全身性过敏反应[10]。本研究中，荆芥-防风中26个活性化合物作用于208个靶点，其中作用靶点较多的关键活性成分有槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、汉黄芩素、豆甾醇等。槲皮素为一种免疫抑制剂，它能够通过血清免疫球蛋白E（IgE）高亲和力受体（FCεRI）交联诱导肥大细胞系HMC-1细胞，抑制HMC-1细胞分泌内胰蛋白酶和IL-6释放，同时下调HMC-1细胞组氨酸脱羧酶（HDC）mRNA的转录，导致组胺释放减少[11]。木犀草素能降低炎症因子转录调节因子的活性，减少促炎细胞因子和炎症介质的产生[12]。化合物-靶点网络中作用较多的关键靶点有 PTGS2、DPP4、F2、HSP90AA1、NCOA2、PTGS1等。PTGS1中的2个单核苷酸多态性（rs10306194和rs1330344）与急性荨麻疹/血管神经性水肿呈正相关（P值分别为0.014和0.019），PTGS1中的部分变体和PTGS2中的一些变体有关联[13]。HSP90AA1为一种热休克蛋白，其调控IRAKI（interleu-kin-1 recepoter associated kinase 1）折叠成正确构象的速率来实现巨噬细胞耐受，进而影响炎细胞因子和炎症介质的产生[14]。

通过GO富集分析发现，荆芥-防风药对治疗荨麻疹筛选出的核心蛋白主要发生在BP环节，如分子功能的正调节、对有机物质的反应、生物合成过程的正调节和细胞凋亡调控等。通过KEGG富集分析，得出的通路中与荨麻疹相关的有：T细胞受体信号通路、NOD样受体信号通路、Jak-STAT信号通路、Toll样受体信号通路、FCεRI信号通路。T细胞受体信号通路涉及的靶点有 IL4、AKT1、TNF、IFNG等；NOD样受体信号通路涉及的靶点有IL6、HSP90AA1、TNF、IL8等；Jak-STAT信号通路为近年来发现的一条通过细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程[15]，涉及的靶点有 IL4、AKT1、IL6、IFNG等；Toll样受体可启动先天免疫反应，过度激活将产生炎症反应，其通路涉及靶点有AKT1、IL6、TNF、IL8等；FCεRI信号通路是引起变态反应性疾病的关键，涉及的靶点有IL4、AKT1、TNF等。

综上所述，荆芥-防风药对治疗荨麻疹是一种多靶点、多通路的协同治疗。通过AKT1、IL6、IL4、TNF等靶点调节炎症细胞因子，通过调控T细胞受体信号通路、Jak-STAT信号通路、FCεRI信号通路等治疗荨麻疹。由于网络药理学的局限性，后期还需对预测出的靶点进行药理学实验验证，以为进一步探讨荨麻疹的发病机制及新型药物的开发奠定基础。同时，药对作为中药方剂的最小组成单位，从药对入手，结合网络药理学方法研究复杂中药方剂，可为中药多成分、多靶点的复杂药物系统的作用机制研究提供参考。

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