【摘要】  目的 调查黎族3个支系Y染色体上3个短串联重复序列基因座及单倍型的遗传多样性,探讨黎族不同支系的起源与关系。 方法 对所有样本的3个Y-STR位点进行PCR扩增，产物在ABI PRISMTM377 DNA Sequencer 上进行电泳，结果用Genotyper 2.5软件进行分型。 结果 在3个Y-STR基因座，3个支系人群共发现15个等位基因，25种单倍型。本地黎12个等位基因，8种单倍型，杞黎10个等位基因，9种单倍型，亻孝黎10个等位基因，20种单倍型。单倍型的遗传多样性分别为0.611，0.677，0.871。 结论 调查的3个Y-STR基因座的等位基因分布有较好的地区种族差异，对海南岛黎族起源、迁移以及各群体的相互关系研究有重要意义。

【关键词】  Y染色体;短串联重复序列;单倍型;黎族

Analysis of polymorphism of three human Y-chromosome STR loci: DYS390, DYS393 and DYS395 in three Li ethmic subpopulation of Hainan Island.

LI Dong-na, OU Cai-ying, ZHOU Zhen-jian, et al.

(Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan , P.R.China)

    

Abstract:Objective  To investigate the polymorphism of allelic frequencies and haplotype frequencies of three Y-chromosome STR loc: DYS390, DYS393 and DYS395 in samples of three Li ethmic subpopulation.  Methods  Three loci in all samples were amplified by PCR. Products were electrophoresed on ABI PRISMTM377 DNA sequencer.The results of electrophoresis were analyzed by Genotyper 2.5 software.  Results  There 15 alleles and 25 genotypes were found in Li ethmic subpopulation on Hainan Island. 12 alleles and 8 haplotypes in Benti-Li group, 10 alleles and 9 haplotypes in Qi-Li group, 10 alleles and 20 haplotypes in Ha-Li group. The haplotype genetic diversity are 0.611，0.677，0.871.  Conclusion  The high informative haplotypes make these Y-STRs useful for investigation of the origins and migration of monority nationalities and their relationship.

    Key words:Y-chromosome; Short tandem repeats; Haplotype; Li ethmic population

    Y染色体的短串联重复序列(Y chromosome specific short tandem repeats, Y-STR)是在人类基因组中广泛存在的一类2~6个核苷酸的重复，由于其具有丰富的多态性，特别是具有严格的父系遗传特征，可为父系相关的遗传信息研究，提供可靠的群体遗传信息,尤其适用于遗传关系较近的群体。近年来已广泛用于连锁分析、个体识别、群体遗传学分析以及人类进化的研究[1,2]。黎族是中华民族的重要成员，是海南岛特有的少数民族,但黎族的起源一直存在着争议。为探索DYS393和DYS395基因座各等位基因频率在中国海南岛不同支系的分布，从分子人类学角度探讨黎族起源，我们对海南岛黎族的3个支系共227人进行了筛查。

1  对象与方法

1.1 样本来源 

根据知情同意原则,分别从海南岛黎族3个支系的主要居住地区,随机选取3代以上均为同一黎族支系的无亲缘关系的本地黎、杞黎和亻孝黎男性血样227份,每人取外周血2~3ml,EDTA抗凝,用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA[3]。

1.2 PCR扩增 

引物设计参照基因数据库(The Genomic Database, the Johns Hopkings University, Baltimore, USA, GDB), 荧光染料标记的微卫星引物由上海基康公司合成。PCR扩增按Perez等[4]的方法，总反应体系5μl,使用PE公司的9600型PCR反应仪，94℃变性12min, 采用两相循环。第一项循环:94℃ 30s，65~55℃ 30s, 72℃ 50s, 共10个循环;第二项循环:94℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 30s, 共30个循环。最后72℃延伸10min。产物4℃保存。

1.3 基因扫描与分型 

将PCR产物用去离子水50倍稀释，取稀释样2μl与2μl含有GENESCAN400HD Size Standard 的上样缓冲液混合后95℃热变性5min，冰浴。取变性产物2μl在ABI PRSMTM377DNA Sequencer 上用含6%聚丙烯酰胺凝胶的12cm胶板电泳2h。由Genescanner 3.1软件对电泳结果进行分析，扫描结果用Genotyper 2.5 软件进行分型。

1.4 数据分析 

等位基因频率用直接记数法，以公式GD=n/(n-1)(1-∑Pi2) 计算基因多样性，单倍型多样性，用公式HD=1-∑Pi2，与其他人群比较用Fisher’s 精确检验。

2 结果

2.1  等位基因多样性

在3个基因座检测黎族3个支系人群共发现15个等位基因。本地黎12个等位基因，杞黎10个等位基因，亻孝黎10个等位基因。其中杞黎群体在DYS393和DYS395基因座的基因多样性(GD)都较低，仅为0.2785和0.2584。亻孝黎群体未发现基因多样性较低的位点，都在0.5以上。在三个基因座中，DYS390位点三个支系最常见的等位基因位点都是等位基因216，在DYS393位点，本地黎、杞黎最常见的等位基因是128，其中杞黎高达0.844。但亻孝黎在该基因座最常见的等位基因是124。在DYS395基因座本地黎、杞黎最常见等位基因是123，其中杞黎高达0.857，亻孝黎是119(见表1)。表1  黎族3个支系群体中3个基因座的基因频率及基因(略)

2.2 Y-STRs单倍型和单倍型多样性 

在3个黎族支系群体共发现25种单倍型，其中本地黎8种，杞黎9种，而亻孝黎20种。有5种单倍型H12、H13、H16、H20和H22为3个黎族支系共享(见表2)。

3 讨论

    人类基因组多样性计划(HGDP)是继人类基因组计划之后又一世界新的科学研究热点。HGDP就是使用分子人类学新技术研究比较不同人种、民族、人群基因的遗传学结构，并结合历史学、考古学和语言学等准确定义世界不同人群的起源[5]。中国是一个多民族的国家，由于历史的原因，不同的少数民族逐渐形成了自己或大或小的聚居区，他们不仅在语言、文化习俗、生活习惯上有差异，而且在体质特征和遗传结构上也存在着差异。为此，研究不同民族群体的遗传多样性，对了解他们的起源、迁徙以及相互关系有重要意义。

    黎族是海南岛特有且古老的少数民族，语言属汉藏语系壮侗语族黎语支。根据方言、文化特征、生活习惯以及人种学上的差异，有些学者将黎族分为本地黎、杞黎、亻孝黎、加茂和美孚黎五个支系，这些群体在远古的不同时期迁徙到海南岛，他们的起源及其相关系，一直存在不同的观点[6,7]。由于黎族的历史悠久、所处地理位置特殊，与大陆隔离时间久远，尤其是他们与东南亚群体的千丝千丝万屡的联系，使黎族的起源一直受到人类学家的关注。为探讨黎族不同支系的父系遗传结构及他们之间的遗传关系，并为黎族的起源与进化研究提供分子人类学证据，本研究对黎族的本地黎、杞黎和亻孝黎人群DYS390、DYS393和DYS395基因座的多态分布进行了调查，结果显示DYS390基因座在三个黎族支系群体共观察到5种等位基因，在三个支系中，DYS390*212，DYS390*216，DYS390*220的频率占99%以上，且最高频率均是DYS390*216，经Fisher检验两两比较显示,三个黎族支系间无统计学意义(P＞0.05)。与其他人群比较显示，黎族三个支系最常见的等位基因DYS390*216与邻国东南亚的越南、马来西亚以及大洋州的新几内亚人群是一致的[8]，而中国的汉族、日本、美洲印地安均以DYS390*212最多见[9]。两两比较显示，黎族与上述群体差异均有统计学意义(P<0.01)。表2  黎族三个支系群体的单倍型序号(略)

    

从以上3个Y-STR位点的等位基因频率在三个黎族支系的分布及与其他人群的比较中，我们看到，黎族群体除在DYS395基因座与马来西亚群体差异无统计学意义(P＞0.05)，与其他人群在三个Y-STR基因座均显示有意义的不同。这表明，调查的三个Y-STR基因座的等位基因分布有较好的地区种族差异，黎族与其他群体的显著不同可能是因为海南岛黎族有一个有限数量的建立者，而且在历史上由于地理上的特殊位置，导致其相当一段时间与外界隔绝，所以形成海南岛黎族特殊的遗传结构。同时我们还注意到，在所观察的三个基因座中，本地黎与杞黎在三个位点中均是一致的，这不仅提示本地黎与杞黎有共同的祖先，而且在DYS393和DYS395基因座最常见等位基因高频率分布上，也反映了建立者效应对海南岛黎族群体遗传结构的影响。同时黎族群体在DYS393基因座最高等位基因频率的分布与百越起源的壮族一致，以及在DYS390和DYS395基因座最常见等位基因频率分布与南岛语系越南、马来人群出现一致性的结果。这些结果与对黎族的语言学、考古学、文化、风俗等研究的结果是符合的，在语言学分类上，黎族属于汉藏语系壮侗语族黎语支，同时也有学者曾根据对黎族的纹身、妇女服饰、风俗、织物等方面的研究后指出，黎族群体与南洋各民族所有者大同小异，为此提出黎族可能源于马来族等南洋各民族的结论[13]。这些结果都提示，黎族群体与百越及东南亚的某些民族有较近的亲缘关系。这与我们的Y-SNP研究结果也有很好的一致性[14]，我们Y-SNP的研究结果再次提示了黎族是一个非常古老的民族，各支系有共同的百越起源以及与南岛语系的民族基因库可能存在着某些融合。黎族不同支系有共同的起源，这一点从我们对3个黎族支系3个基因座组成的单倍性多样性分析中也得到支持，在黎族3个支系中我们共观察到25种单倍型，但3个支系人群有84.58%的个体共享5种单倍型H12、H13、H16、H20和H22。

    

在三个Y-STR基因座的检测中，我们发现本地黎、杞黎单倍型多样性(HD)较低，这提示这2个群体在人类进化的历史中可能经历了遗传漂变。用于法医学个体识别则需要增加更多的基因位点。同时，亻孝黎在各基因座却是具有较高遗传多样性的群体，这种较高的HD值可能来源亻孝黎群体首批登陆海南岛的远古祖先，他们是具有较高遗传多样性的群体，且这个群体在历经上万年进化未发生过漂变。当然也可能是另一个原因，即亻孝黎群体与其他民族群体有基因交流，而且这种可能性显然是不能排除的。根据文史资料记载，亻孝黎是海南岛黎族五个支系中人数最多的一个群体，“亻孝”是黎语中的音译，是海南岛中心地区的黎族对外围地区的黎族的称呼，在海南岛亻孝黎的居住地区也多在黎族居住区的边缘部分，或于汉族杂居地区。风俗习惯受汉族影响也较深，为此亻孝黎也被称为“熟黎”[6]。根据史书清*《崖洲志》记载:熟黎多湘广、福建之奸民，亡命杂焉。可见，汉族基因有相当一部分流入黎族群体基因库中。为此，我们可以推测，亻孝黎群体较高的基因多样性是由于与汉族群体基因交流的结果。在各等位基因最常见等位基因频率分布上也支持这一可能性，亻孝黎群体的最常见等位基因频率仅在DYS390位点与本地黎、杞黎一致，而在其他两个基因座均存在显著性差异，在DYS395位点与中国汉族一致。

    

本研究揭示了DYS390、DYS393和DYS395基因座在黎族三个支系人群中的多态性，为研究黎族人群的遗传进化、起源及法医学应用提供了分子人类学数据，但黎族起源的揭示尚有待于更多Y-DNA基因座及线粒体DNA等其他多态位点的研究来进一步证实。

【参考文献】

  目的 调查黎族3个支系Y染色体上3个短串联重复序列基因座及单倍型的遗传多样性,探讨黎族不同支系的起源与关系。 方法 对所有样本的3个Y-STR位点进行PCR扩增，产物在ABI PRISMTM377 DNA Sequencer 上进行电泳，结果用Genotyper 2.5软件进行分型。 结果 在3个Y-STR基因座，3个支系人群共发现15个等位基因，25种单倍型。本地黎12个等位基因，8种单倍型，杞黎10个等位基因，9种单倍型，亻孝黎10个等位基因，20种单倍型。单倍型的遗传多样性分别为0.611，0.677，0.871。 结论 调查的3个Y-STR基因座的等位基因分布有较好的地区种族差异，对海南岛黎族起源、迁移以及各群体的相互关系研究有重要意义。

作者单位:海南医学院生物教研室，海南 海口 571101.