加载中…蛋白质表达中的密码子优化策略
(2016-11-04 16:54:07)
标签：
杂谈 |
分类： 生物实验 |
密码子优化是蛋白质高效大量表达的方案之一，目前由于工业生产的需要，有些蛋白质需要大量表达以投入生产，但是在表达蛋白质的时候，很多都是异源表达或许基因序列GC含量比例不当等一些原因，导致表达量不高，还有一些是含有终止密码子或载体上的酶切序列，这些都会影响到蛋白表达，但这些都可以通过密码子优化，使要表达的基因序列适合相应的宿主，达到大量表达的目的。密码子优化涉及到的优化点有基因合成、载体构建、基因转录、mRNA翻译、酶切位点设计等，最终目的是使蛋白高效大量表达。http://s12/mw690/005K64OIzy769zsQrFN8b&690
随着生物技术的发展，已经有越来越多的领域利用异源表达系统生成出重组蛋白，也有很多相关学者致力于这方面研究，在蛋白重组表达中，很多研究者在设计方案时比较注重选择合适的表达载体和宿主系统，而往往忽视基因本身是否与载体和宿主系统为最佳匹配这样一个实质性问题。实际上基因本身也会直接影响到蛋白的表达，如何通过对基因本身进行优化使之能够达到最优表达也应成为设计方案时所注重的一点。基因的表达优化可以通过对基因的重新设计和合成来实现。本文将从以下几个方面来探讨蛋白表达中基因的密码自由化策略。
1消除稀有密码子
遗传密码子有64种，但是每种生物倾向于利用的密码子不同。那些被频繁利用到的称为这种生物的最适密码子，那些不被经常利用的则被称为稀有密码子。很多宿主在不同程度上都表现出对密码子的偏爱，如果要表达的基因的密码子不是宿主表达所偏爱的密码子，就会影响到基因表达的速率和丰度。另外，如果稀有密码子出现在靠近蛋白质N端，或者稀有密码子连续出现3个以上，则蛋白质的翻译速率会大大降低，因此对稀有密码子改造显得尤为重要，这些可以通过基因合成来实现。首先确定表达某条基因之前，先确定需要用的宿主，然后查询这条基因中存在的相对于宿主的稀有密码子；如果稀有密码子太多，则需要对密码子进行优化，消除密码子，将优化后的序列重新合成，如果稀有密码子不是很多，在10％以内通过突变来消除。
2调整GC含量
研究表明，基因序列中的GC含量也是基因设计和优化中的重要指标，不同物种内GC含量显著不同，在用宿主表达外源基因时要注意外源基因的GC含量。GC含量间接影响基因的表达和调控，含量过低或过高都会基因的表达，一般是使表达水平降低可通过基因密码子优化来调整基因内的GC含量，使之达到正常水平，这点可通过基因合成来实现，GC含量的预测和调整一般可通过软件进行分析。
3增加mRNA的稳定性
蛋白质的表达调控一般分为两种，即转录水平的调控和翻译水平的调控，一般转录水平的调控起到关键性的作用，但同时翻译的效率与mRNA的降解又直接相关。蛋白表达已多次被证明与mRNA的稳定性相关，但目前对于mRNA的稳定性优化不是很成熟，一方面，过高的mRNA稳定性也就意味着GC含量以及稳定性的二级结构，这些都不利于蛋白的高效表达，因此mRNA稳定性优化有待进一步研究。.
4mRNA的二级结构
由于核糖体只能与单链的RNA结合起始翻译，而较大的折叠自由能可能会减缓核糖体的延伸从而降低翻译效率。因此如果mRNA形成较大且稳定的茎环结构或发卡结构，特别是在起始密码子附近形成这种稳定的二级结构将会影响mRNA在翻译过程中与核糖体的结合和延伸，从而降低翻译效率最终影响到蛋白质的表达。因此可以通过mRNA二级结构优化尤其是翻译起始区二级结构优化来提高蛋白表达水平。
5其他因素
密码子优化因素还包括密码子的重复、核糖体结合位点、起始密码子环境、终止密码子环境、酶切位点设计、合理的接头设计、融合基因、纯化标签等，通过进一步设计，使基因得到进一步优化，检查无误后可进行基因合成，以用于后续的蛋白表达。
6讨论
经过大量的实验验证，经过密码子优化后的基因的表达量明显高于没有做密码子优化的基因，由此可以看出密码子的优化和蛋白质的有效表达有着密切的联系。比如Kudla等构建的包含154种不同随即密码子同义突变的GFP蛋白突变体库，研究mRNA折叠自由能对效率的影响实验，以及Desmit等通过对噬菌体NS2的外壳蛋白基因的同义密码子突变体在大肠杆菌中的表达，定量分析了翻译起始区mRNA的二级结构与翻译起始效率的关系。实验表明较大的折叠自由能会降低蛋白质的翻译效率。另外Punginelli等通过突变大肠杆菌FdnG信号肽的第一个精氨酸R5，降低了翻译起始区强稳定性茎环结构的形成，显著降低了mRNA该区域的折叠自由能，使蛋白质的表达增加了60倍。总之，通过有效的基因优化可以明显提高蛋白表达量，这为蛋白质的大量表达和量化生成提供了很好的前提。同时还有很多存在问题需要去进一步的研究以达到更高的效果。
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