1）收集培养发酵液，4度7000-8000g离心10分钟，收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-70度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。

2）取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，0.5mg/ml溶菌酶，1mM PMSF，1mM MgCl2，1.7units/ml Benzonase,其中的酶，1mM PMSF，1.7units/ml Benzonase现加）在冰上混合45分钟，如果pH不在7-8，需要用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到10分钟. 

3）把混合菌体在冰水中用超声探头破碎20秒种,总共四次,中间间隔要保持2分钟冷却破碎液,检测pH,如果不在7-8,还是用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为1升,破碎三次,压力为800 bar。

4）破碎的液4度12000g离心10分钟，如果要让溶液更澄清，可以4度50000g离心30分钟，这时候可以把上清和沉淀分别留样，跑电泳，如果只沉淀中有目标蛋白，那就用变性条件下去纯化蛋白。

 5）破碎离心的上清加2M咪唑溶液0.12ml使终浓度为20mM，样品的总体积为10ml。过柱子的样品最好过0.45μm的滤膜，避免堵柱。

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（二）可溶性蛋白纯化

 1）平衡缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含20mM咪唑。

 2）洗脱缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含500mM咪唑。

 3）取1ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，然后取破碎上清10ml样品以0.5ml/min上样，然后2ml/管分管收集。

 4）用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。

 5）用5 ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。

 6）再用5ml平衡缓冲液平衡柱子，灌满20%乙醇，封闭，以备下次使用。

7）此方法是通用的方法，但是未必能得到适合自己蛋白的满意效果，所以优化的办法是洗脱可以用50mM，100mM，300mM，500mM分阶段洗脱，各洗脱5个柱体积，这样配合电泳检测，得到适合自己的蛋白的条件。

 8）收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考玛斯亮蓝法测定蛋白的浓度，再取有蛋白的部分电泳检测纯度。

9） 其问题和解决方法可以参考可溶性蛋白表达的相关内容。 复性十分复杂，所以建议参考文献和一些专门的论述。

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