真核细胞蛋白表达因其自身的优势被广泛的应用到活性蛋白的生产领域。同时哺乳动物真核细胞蛋白表达能够实现复杂的糖基化，乙酰化等修饰功能，表达的蛋白更接近其天然状态。利用真核细胞蛋白表达的方式有两种：瞬时转染表达和细胞稳定转染。瞬时转染表达蛋白能够在短期内得到少量蛋白，蛋白活性有保证，但是满足不了大量生产需求。本文主要介绍了瞬时转染表达技术的原理，瞬时转染表达的一般流程和影响细胞瞬时转染的影响因素。

瞬时转染表达

瞬时转染表达技术是指外源基因导入到细胞后得以表达，但是基因不整合到细胞的基因组上，因此不会随着细胞的生长复制。因此，瞬时转染表达蛋白的时间有限，通常只持续几天，直到外源基因在细胞生长分裂过程中因各种因素消失为止。判断细胞是否瞬时转染成功，在构建质粒上含有报告基团，以指示目标基因是否存在，一般在瞬时转染表达两天后即能被检测到。

瞬时转染表达技术一般流程

以24孔板进行瞬时转染表达为例，HEK293真核表达为例全程操作均为无菌状态，以免造成细胞污染

瞬时转染表达前准备，细胞株或者直接培养后的细胞用胰蛋白酶消化后计数，铺板，培养基为含有1ml血清，不含抗性的正常培养基。

针对每孔（HEK293真核表达为例）细胞，用50-100ul无血清培养基稀释0.8-1.6ug的质粒，并混匀

针对每孔细胞，用50-100ul无血清培养基稀释4ul左右的瞬时转染试剂，混匀室温防止5min

将第二第三步的溶液混匀室温防止20-30min

用PBS冲洗HEK293细胞，在用无血清培养基冲洗细胞，在加入0.5ml的无血清培养基

将四步骤得到的混合物加入到每孔中，轻摇混匀后放入37℃，5%的二氧化碳培养箱中培养5-6h

将无血清培养基换为血清培养基（10%胎牛血清）孵育24-96h后检测结果。稳定表达，在瞬时转染24h后传代至新鲜培养液中，48h后加入抗性，稳定表达需要数周时间。

影响瞬时转染表达效率的因素

1. 瞬时转染表达试剂

瞬时转染表达和稳定转染表达可以选择不同的转染试剂，瞬时转染表达的试剂的选择又可以根据已经发表的文献。已经有很多细胞株被成功转染，通过文献资料可以参考最适的转染试剂，当然也要根据不同的实验需求选择。此外，不同的瞬时转染方法也要选择不同的试剂，一般要求是转染试剂要低毒，高效，廉价易得。

2. 细胞转染的方法

细胞转染方法分为两类：瞬时转染表达和稳定转染。细胞转染方法的选择对转染结果影响也很大，。根据细胞的性质及不同的操作手法，摸索最佳的转染条件。瞬时转染表达和稳定转染都需要优化DNA 与转染试剂比例， 细胞培养及检测时间。一些传统的瞬时转染表达技术，如磷酸钙法，电穿孔法，脂质体转染法都各有利弊，关于各种细胞转染方法的比较和原理，可参见细胞培养方法的比较。

3. 细胞状态

一般传代数小于50代以下的细胞即能保证基因型不变。瞬时转染表达最合适的细胞是达到对数生长期的细胞，此时细胞生长旺盛，最容易被转染。同一种系的细胞株，在不同实验室不同培养条件下，其生物学性状都会产生不同改变，从而导致其转染特性也发生变化。因此，针对这种转染效率降低的情况，应转用新鲜培养的细胞转染达到好的结果。

4. 载体构建

基因产物对细胞不能有毒害作用，瞬时转染表达难以进行。转染载体的构建选择可调控，强度合适的启动子很重要，可以做空载体或相同载体的其他基因为对照排除毒性对细胞的影响。 病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞。

5. 其他要求

（1）细胞培养基

培养基是瞬时转染表达技术中的最基本要素。不同细胞选择不同的培养基，血清和其他添加物。使用的转染试剂要参考其说明书。培养物一定要避免细菌，支原体真菌的污染。

（2）血清

血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的成分不明确添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响细胞生长，因此也会影响细胞转染效率，不同批次购买的血清质量也会存在差别。对于传统的转染方法要求在无血清培养基条件下转染，血清被认为会降低瞬时转染的效率。针对现有人们常用的的转染试剂来说，血清的存在已不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率。在转染过程中完全可以使用血清，针对RNA 转染，消除血清中潜在的核糖核酸酶污染要格外关注。且血清比较珍贵，胎牛血清，马或牛血清都常被用到，价格也不尽相同，根据自身选择。

（3）细胞密度

细胞密度对瞬时转染表达效率也有一定影响，这里采用的是HEK293真核表达（培养的是HEK293细胞）一般转染时贴壁细胞密度为50-90%，具体要根据选用的转染试剂的说明书。不同的转染试剂最适的细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。

例如阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而要更高的细胞铺板密度或更多的悬浮细胞数， 尽量在细胞最适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果。

（4）DNA 质量

针对一般常用的转染技术都是基于电荷吸引的原理转染的（瞬时转染表达技术即是），如果DNA的纯度不高，存在其他杂质，如盐离子等都会影响转染复合物的形成。针对市面上现有的超纯质粒抽提的试剂盒，能达到非常高的纯度效果，从而可以避免DNA纯度的影响。

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