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什么是荧光比率指标

(2019-04-09 10:40:23)

离子在许多生理过程中起着错综复杂的作用。例如,细胞内钙离子在促进神经
元释放神经递质的信号转导途径中是必需的,并且涉及所有肌细胞收缩所需的机
制。细胞离子浓度由被动和主动离子通道和泵调节。离子通道和泵中的故障可导致
离子浓度的不适当调节,从而产生不利于正常细胞功能的条件。
为了研究细胞离子通量,离子成像技术与荧光离子指示剂结合使用。荧光离子
指示器分为两类:单波长指示器或比率指示器。对于定性分析,建议使用单波长指
示器。它们的大动态范围使它们在检测适度和瞬态离子变化时非常敏感。遗憾的
是,与单波长指示剂的使用相关的诸如可变染料加载和挤出的缺点使得难以准确地
确定细胞离子浓度。由于这些原因,建议使用比率指标来定量测量离子浓度。
比率或双波长离子指示剂是荧光染料的子类别,用于定量测量细胞内离子浓
度。与单波长指示器相比,双波长指示器具有独特的光谱特性,其响应于其目标离
子的结合而被触发。在比率钙指示剂的情况下,当与游离 Ca 2+结合时,这些染料
的最佳吸收或发射波长强度发生变化。例如,当激发 Ca 2+结合或不结合 Ca 2+
时,双激发 Ca 2+指示剂表现出两个峰值激发波长。Ca 2+增加当分别在 Ca 2+结合
和无 Ca 2+峰激发波长激发时,浓度引发双激发指示剂的荧光发射强度的增加和减
少。使用从收集的光度数据得出的比率,研究人员可以准确地确定细胞内 Ca 2+
度。比例技术是有利的,因为它降低了指示染料负载不均匀,染料保留性差和光漂
白的效果。自 1985 年由 Tsien 和合作者引入以来,比率指标已被无数科学论文引
用,并有助于研究钙在细胞调节中的作用(Grynkiewicz 等,1985)。


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Fura-2  Indo-1

比率指示器是检测和成像目标离子浓度中的通量的有力工具。钙指示剂,例如
Fura-2  Indo-1,是紫外可激发的荧光分子,用于研究钙在细胞水平上的调节作
用。根据 fura-2  indo-1 的钙螯合部分的结合状态,这些比率指示剂将经历其
最大激发或发射波长的变化。Fura-2 及其类似物是用于测量细胞内 Ca 2+浓度的激
发比率指示剂。与游离 Ca 2+结合后这些双激发指示器经历吸收向蓝色光谱的移
动,同时保持~510nm 的固定发射波长。具有不含 Ca 2+螯合剂的 Fura-2 指示
剂在~363nm 处显示出最大激发波长,而具有 Ca 2+结合螯合剂的 fura-2 指示剂
~335nm 处激发。

 fura-2 相反,fura-2 在与 Ca 2+结合时表现出吸收的变化,indo-1 及其类
似物是用于测量细胞内 Ca 2+浓度的发射比率指示剂。在不含 Ca 2+环境中,
indo-1 ~475nm 处显示出最大发射波长。在与游离 Ca 2+结合后,indo-1 的发
射向~400nm 发射的蓝色光谱移动。无论钙的存在如何,indo-1 ~350nm 
保持最大吸收。此功能使 indo-1 非常适合流式细胞仪应用,在这些应用中,更容
易更换发射滤光片而不是激发光源。


 Fura-2 制备样品

 Fura-2AM 酯比率指示剂制备细胞的样品方案

材料与试剂:

Fura-2 AMCat21020
HHBSCat20011
04Pluronic®F-127Cat20052

标记活细胞:

1.通过将 fura-2AM 溶解在高质量无水 DMSO 中制备 2  5mM AM 酯原液。

2.对于将来的预期用途,将 DMSO 储备溶液储存在-20°C 干燥并避光。

3.对于含有有机阴离子转运细胞的样品,如 CHO 细胞,可将丙磺舒(2-5 mM
Cat20060)加入染料工作溶液中,以减少脱酯指示剂的泄漏。

4.将等体积的染料工作溶液(步骤 2  3)加入细胞板。

5.在室温或 37°C 孵育 1-2.5 小时。

6. HHBS 替换染料工作溶液以除去多余的探针。

7.在适合 fura-2  Ex / Em 波长下运行所需的实验。

Fura-2  Indo-1 的荧光检测

在适当条件下监测比率指示剂的吸收和发射光谱是观察响应于游离细胞内
Ca 2+的指示剂的波长漂移的极好技术。通过在~510nm 处以固定的发射波长扫描
300nm  400nm 之间的激发光谱,可以观察到 fura-2 的吸收移位。同样,
indo-1 可以被流式细胞仪的氩离子激光(~350 nm)很好地激发。当结合游离的
细胞内 Ca 2+indo-1  发射 ~475nm  波长 移动  ~400nm  fura-2 
indo-1 荧光发射的一个关键特征是分别在~360 nm ~460 nm 处存在等糖量点
(图 1此时,两种比率指示剂的荧光强度对游离 Ca 2+浓度都不敏感。另外,
糖尿病点的存在表明良好的实验室实践,因为其缺乏与其他离子的污染或邋 pipe
移液相关。
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附比率钙指示剂的光谱和 Ca2 +结合特性表

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