加载中…流式细胞术中这几个实验和操作要点你知道吗?
(2019-04-04 10:58:08)
流式细胞术中这几个实验和操作要点你知道吗?小编现在就带你了解一下：
流式细胞术原理
被染色的单细胞或颗粒，经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细胞，依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧光素细胞受到激发，产生不同的荧光信号，这些荧光信号可以反映细胞的生物特征。
常用的几种检测
1.细胞凋亡检测及相关分子检测细胞 DNA 含量分布（细胞 DNA 降解方式检测细胞凋亡）
操作步骤：
a. 收集已固定的单细胞悬液，5x105~1x106/ml
b. 离心去固定液，3mlPBS 重悬细胞
c. 1500rpm 离心（5min）去 PBS
d. 加 PI 染料，室温避光 20min
e. 调整细胞浓度，5x105/ml
f. 上机检测试剂：碘化丙啶（PI）（Cat#17515/17516）
2.DNA 周期分析操作步骤同 DNA 检测
注意事项：
a. 单细胞浓度约为 106/ml
b. 制好的标本应使用光学显微镜查其质量，以保证得到足够的细胞含量
c. 醛类固定会影响 PI 与核酸结合
试剂：碘化丙啶（PI）（Cat#17515/17516）
3.免疫荧光标记检测
细胞膜免疫荧光检测操作步骤：
a. 制备单细胞悬液
b. 细胞计数，取出 1×106 个细胞于试管中
c. 用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90～95%
d. 在试管中加入荧光标记的抗体，混匀，孵育 30min
e. 用 PBS 洗 2 次，1500rpm，离心 3min，弃上清
f. 加 300μl PBS(PH=7.4)，上机检测
试剂：台盼蓝（Cat#2450/2452/2453）荧光标记的抗体（见官网）
操作要点
大部分的仪器参数设置都是没有大问题的，导致实验结果不理想的主要原因，还是上机前的细胞处理及实验细节处理。
1.细胞选择及处理
https://img1.dxycdn.com/2019/0404/634/3337919218082837288-14.png
2.注意事项
注意荧光淬灭操作中的孵育时间一定要严格，孵育时间过长会导致荧光淬灭延迟淬灭方法：将试管放入冰中
注意染色顺序遇到多种荧光染色时，可能会因为染色顺序的不同而导致荧光强度不同处理方法：提前进行预实验，尝试多种顺序，选择最佳染色顺序
合适的染色方案选择不合理的染色方案也会导致荧光信号太弱处理方法：提前进行预实验，设计好最佳染色方案
做好阴性对照及同型对照试验细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。
选择合适的抗体原则：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。
流式细胞术原理
被染色的单细胞或颗粒，经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细胞，依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧光素细胞受到激发，产生不同的荧光信号，这些荧光信号可以反映细胞的生物特征。
常用的几种检测
1.细胞凋亡检测及相关分子检测细胞 DNA 含量分布（细胞 DNA 降解方式检测细胞凋亡）
操作步骤：
a. 收集已固定的单细胞悬液，5x105~1x106/ml
b. 离心去固定液，3mlPBS 重悬细胞
c. 1500rpm 离心（5min）去 PBS
d. 加 PI 染料，室温避光 20min
e. 调整细胞浓度，5x105/ml
f. 上机检测试剂：碘化丙啶（PI）（Cat#17515/17516）
2.DNA 周期分析操作步骤同 DNA 检测
注意事项：
a. 单细胞浓度约为 106/ml
b. 制好的标本应使用光学显微镜查其质量，以保证得到足够的细胞含量
c. 醛类固定会影响 PI 与核酸结合
试剂：碘化丙啶（PI）（Cat#17515/17516）
3.免疫荧光标记检测
细胞膜免疫荧光检测操作步骤：
a. 制备单细胞悬液
b. 细胞计数，取出 1×106 个细胞于试管中
c. 用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90～95%
d. 在试管中加入荧光标记的抗体，混匀，孵育 30min
e. 用 PBS 洗 2 次，1500rpm，离心 3min，弃上清
f. 加 300μl PBS(PH=7.4)，上机检测
试剂：台盼蓝（Cat#2450/2452/2453）荧光标记的抗体（见官网）
操作要点
大部分的仪器参数设置都是没有大问题的，导致实验结果不理想的主要原因，还是上机前的细胞处理及实验细节处理。
1.细胞选择及处理
https://img1.dxycdn.com/2019/0404/634/3337919218082837288-14.png
2.注意事项
注意荧光淬灭操作中的孵育时间一定要严格，孵育时间过长会导致荧光淬灭延迟淬灭方法：将试管放入冰中
注意染色顺序遇到多种荧光染色时，可能会因为染色顺序的不同而导致荧光强度不同处理方法：提前进行预实验，尝试多种顺序，选择最佳染色顺序
合适的染色方案选择不合理的染色方案也会导致荧光信号太弱处理方法：提前进行预实验，设计好最佳染色方案
做好阴性对照及同型对照试验细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。
选择合适的抗体原则：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。
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