如何避免钙离子检测时遇到的避免高背景？信号强度低？AAT Bioquest 曾推出过一系列产品：Calbryte™，它是用于检测细胞内钙离子浓度的，比Fluo-4等传统荧光探针有更好的实验效果。Calbryte™包括三种新的钙离子指示剂：Calbryte™520，Calbryte™590  和  Calbryte™630。Calbryte™系列已针对荧光显微镜，荧光酶标仪和流式细胞仪进行了优化，它们还可用于高通量筛选应用。 与传统的Fluo-3、Fluo-4比较，Calbryte™探针具有几个关键优势 ：Calbryte™探针可产生更明亮的信号，显著改善的信号与背景比，并大大增强细胞保留。这些特性使Calbryte™系列成为比传统的钙指示剂更好的选择。

图1 Fluo-4，AM（左）和Calbryte ^TM 520 AM（右）在CHO-K1细胞中测量ATP响应。将CHO-K1细胞以50,000个细胞/100μL/孔接种过夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。加入含有丙磺舒或10μg/ ml Fluo-4的AMH缓冲液中的100μL10μg/ ml Calbryte ^TM 520AM，在含有丙磺舒的HH缓冲液中的AM，并在37下孵育45分钟。然后除去染料加载溶液并用200μLHH缓冲液/孔替换。加入ATP（50μL/孔）以达到10μM的最终指示浓度，然后用显微镜FITC通道（Keyence）成像。

更多关于Calbryte ^TM系列产品的信息？

Calbryte™系列探针根据其最大发射波长命名  。例如，Calbryte™520在可见光谱的绿色区域发出荧光，而Calbryte™590和Calbryte™630分别在红色和深红色区域发出荧光。所有三种指标均可以AM酯形式或盐形式（作为钾盐）获得。AM酯形式是细胞可渗透的形式，其可用于测定活细胞中的钙。盐形式主要用于钙指示剂的校准。当根据荧光信号强度计算细胞内钙浓度时，通常需要该步骤。Calbryte TM的盐形式也可用于显微注射到活细胞和组织中。

Calbryte™染料如何在活细胞中发挥作用？

当测定活细胞中的钙时，优选的方法是用几种乙酰氧基甲酯（AM酯）官能团合成Calbryte ^TM染料。这样做的原因是：

1.AM酯是亲脂性基团，当连接到Calbryte ^TM核心结构时，产生总体上更疏水的化合物。这种增加的疏水性使Calbryte™AM酯易于渗透完整的脂质膜并渗透到活细胞中。这消除了对电穿孔，显微注射或其他类似破坏性加载技术的需要。

2. Calbryte ^TM染料虽然是AM酯形式，但基本上是非荧光的且不可激活的。只有当Calbryte™探针渗透到细胞中时，只有在细胞内酯酶切割AM酯功能基团后，Calbryte™染料才会被激活并对钙有反应。这种两步激活过程很重要，因为它极大地减少了非特异性的背景荧光。并且通过扩展，它显著增强细胞内钙信号。

一旦Calbryte™探针被激活，它就会通过典型的螯合作用来检测钙处理。然而，与其他螯合剂如Fluo-3和Fluo-4不同，Calbryte™染料在与钙结合时显示出更大的响应。在实验中，Calbryte™探针显示螯合时荧光增加超过300倍。相比之下，Fluo-4仅增加了100倍。荧光响应的这种显著改善允许对传统钙指示剂无法检测的钙进行极其稳定的检测。

使用Calbryte™染料有什么好处？

Calbryte™探针胜过更传统的钙质指标。在活细胞实验中，Calbryte™染料产生的信号与背景比率比其他染料如Fluo-4高出一个数量级。这是实验研究的一大优势。正如许多研究人员所证明的那样，信号与背景比率差是数据分析的头疼问题。它将结果与噪声混合在一起，掩盖了潜在的重要数据，并导致大量的分析 - 分析变异性。出于这个原因，在选择试剂时，大多数研究人员更喜欢具有良好信噪比的信号。

信号与背景比率差可能是由多种因素引起的，这些因素主要分为两类。首先，有些因素会导致信号强度不佳。这些可包括：

1. 低消光系数或量子产率

2. 目标结合不良

3. 远离激发源的吸光度最大值（_λmax）

Calbryte™探针的研发就是为了解决这些问题。例如，Calbryte™520的量子产率是Fluo-3或Fluo-4的三倍。这意味着每吸收光的光子，Calbryte™520从根本上发出比Fluo-3或Fluo-4更多的荧光，从而产生更亮的信号强度。此外，Calbryte™系列中的所有染料都经过精心设计，使其最大吸光度出现在标准激发源附近。例如，Calbryte™520（_λmax  = 492 nm）被   常见的488 nm氩离子激光线激发。 

许多探针表现出差的信号与背景比的第二个原因是由于高背景。高背景可能是由于：

1. 细胞不透性

2. 高自发荧光

3. 非特异性激活/结合

4. 细胞保留不良

这些因素中的许多是相关的，因为它们涉及探针进入细胞并在细胞质中有效定位的能力。观察许多过去的钙指标，它们经常遇到两个问题之一。1）探针可以是相当水溶性的，但是太亲水而不能渗透活细胞。2）它们具有足够的疏水性以渗透活细胞，但是具有如此差的水溶性以至于它们在加载过程中会从溶液中沉淀出来。这两种情况都不可取。使用Calbryte™系列时，面临的挑战是创造一种在水溶性和细胞渗透性之间达到微妙平衡的探针。Calbryte™系列通过操纵水溶性官能团和上述AM酯基解决了这个问题。

    钙指示物在活细胞实验中表现不佳的另一个原因是细胞保留不良。这里的问题在于一个叫做p-糖蛋白1的蛋白质家族  （P-gp）的。在许多细胞中（例如研究良好的HeLa细胞系），P-gp充当ATP依赖性外排泵，主动将大范围的小分子从细胞内移动到细胞外空间。关于钙指示剂，这引起问题，因为活化的钙指示剂可以通过这些泵“泄漏”出细胞并进入细胞外基质。这种类型的泄漏导致双重问题。首先，因为泄漏的钙探针已被激活（由于通过细胞内酯酶去除AM酯），它们将与细胞外基质中的游离钙结合并发荧光。然而，该荧光不是感兴趣的信号，因此有助于已知的高背景或噪声。第二，探针泄漏到细胞外空间导致细胞内探针的减少。这导致细胞内钙的检测减少和信号强度降低，进一步加剧了该问题。

一个已被熟练使用的解决方案是将丙磺舒与钙指示剂一起使用。Probenecid是一种通道阻滞剂，在减少探针泄漏方面取得了一定的成功。但是，它的使用远非理想的解决方案。这是因为有许多实验目标对丙磺舒非常敏感。例如，已显示感觉神经节的TRPV2受体被丙磺舒激活。另一方面，丙磺舒似乎对TAS2R受体或味觉受体具有抑制作用。对于许多其他血清敏感或药物敏感的靶标，丙磺舒的作用可能在很大程度上是未知的。这意味着通过使用丙磺舒，研究有可能将完全未知的因素引入实验设计中。 

    Calbryte™注意到现有钙指示剂存在的这一严重问题，专为高性能而设计，无需丙磺舒。Calbryte™染料通过仔细平衡化合物上的离子电荷来实现这一目标。这导致带负电荷的亲水性分子，一旦进入细胞内，就显示出显着减少的细胞渗漏。在无丙磺舒条件下，Calbryte™染料在信号背景比方面优于Fluo-4一个数量级。 
    Calbryte™染料的最后一个优点是它们非常适合高通量筛选（HTS）和药物发现应用。由于Calbryte™染料具有如此出色的信号与背景比，因此可以无洗涤形式使用（见Cat#36317）。此外，由于不需要添加丙磺舒，Calbryte™染料可以很容易地用于自动化设置。 

用Calbryte ^TM 520 AM和Fluo-4 AM在CHO-M1细胞中测量卡巴胆碱剂量反应。将CHO-M1细胞以50,000个细胞/100μL/孔接种过夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。加入在HH缓冲液中的100μL10μg/ ml Calbryte ^TM 520AM或在HH缓冲液中的10μg/ ml Fluo-4，并在37下孵育45分钟。然后除去染料加载溶液并用200μLHH缓冲液/孔替换。通过FlexStation 3添加卡巴胆碱（50μL/孔）以达到最终指示的浓度。

Calbryte™系列产品应用了国外成熟的技术，成功避免了高背景、信号低等问题，详情咨询百萤生物。