加载中…石蜡切片免疫组化步骤（新手必读）
(2019-01-23 14:15:01)实验共分两天来做效果最佳
第一天
1、脱水
(1)、65烤箱干烤 30min。（具体时间视切片大小多少可调整，一般不要超过1h，否则容易脱片）
(2)、二甲.苯中 15min，之后二甲.苯中 15min。
(3)、在无水乙醇，无水乙醇，95%酒精，80%酒精，70%酒精中分别浸泡各5min。（2、3 这
两步都是跑缸的，实验室应该有专门的缸，直接放里面就行了）
(4)、双蒸水浸泡 5min
2、微波修复抗原：将切片浸入 pH6.0，0.01M 枸橼酸修复液中（配制方法见步骤末尾），电炉或微波
2、微波修复抗原：将切片浸入 pH6.0，0.01M 枸橼酸修复液中（配制方法见步骤末尾），电炉或微波
炉加热至 92 至 98，持续
15min（注意不要煮沸）。冷却后（不能人工降温，不能在冷却前将切片从
热水中取出）进行下一步。对于这一步，首先配制好抗原修复液（根据你的抗原在胞质还是胞核表达而不
同，胞质的选用枸橼酸修复液，胞核的选用 EDTA 修复，EDTA 在此暂不做详细说明），接着将双蒸水中
同，胞质的选用枸橼酸修复液，胞核的选用 EDTA 修复，EDTA 在此暂不做详细说明），接着将双蒸水中
浸泡后的切片放入修复液中，拿至微波炉加热修复，在此我仅述我们的修复过程以供参考。
修复液盒子外面另外放一盛水的盒子，防止修复液沸腾蒸发，首先高火烤 8 分钟（具体时间视切片多少调整），
修复液盒子外面另外放一盛水的盒子，防止修复液沸腾蒸发，首先高火烤 8 分钟（具体时间视切片多少调整），
发现修复液沸腾后立刻停止，如果未沸腾再继续延长烤时间，结束后等待 1min，接着中火烤 1min30s，停
1
分钟，再中火烤1min30s，停 1 分钟，如此循环共计 30
分钟，结束后将整个装有抗原修复液和切片的盒子摆
到阴凉处自然晾干，晾干后再进行下一步。
3、室温下 PBS 洗涤 5min×3 次。（切片全部浸泡在玻璃缸中加入 PBS 液放入摇床，5min 后取出倾去液体，
3、室温下 PBS 洗涤 5min×3 次。（切片全部浸泡在玻璃缸中加入 PBS 液放入摇床，5min 后取出倾去液体，
重新加 PBS，如此洗涤 3 次）
4、3%双..氧..水室温孵育 15min，以消除内源性过氧化物酶的活性。
5、室温下 PBS 洗涤 5min×3 次。（见第 3 步说明）
6、封闭：滴加正常羊血清封闭液（A 试剂），37孵育 30min（具体时间长短视情况而定，时间太长可能导致
4、3%双..氧..水室温孵育 15min，以消除内源性过氧化物酶的活性。
5、室温下 PBS 洗涤 5min×3 次。（见第 3 步说明）
6、封闭：滴加正常羊血清封闭液（A 试剂），37孵育 30min（具体时间长短视情况而定，时间太长可能导致
特异性抗体也被封闭，做不出结果来）。甩去多余的液体，不冲洗。
7、滴加适当稀释的一抗(抗体用 PBS 稀释，具体稀释浓度见抗体说明书，一般刚开始做的时候多试验几个浓度，
7、滴加适当稀释的一抗(抗体用 PBS 稀释，具体稀释浓度见抗体说明书，一般刚开始做的时候多试验几个浓度，
如 1:50,1:100,1:150
等，以寻找出效果最好的抗体稀释浓度)，4过夜，我们一般是将切片摆到底下盛有水的湿
盒中放入 4冰箱过夜。（举例 1:100 稀释方法：99μL 的 PBS 中加入 1μL
的抗体。）
第二天
8、取出昨天过夜的湿盒，37 度复温 30min，PBST 冲洗 5min×3 次。
9、滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔 IgG（B 试剂），37 孵育 30 min。
10、PBST 冲洗 5minX3 次。
11、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液（C 试剂），37 孵育 30 min。
12、PBST 冲洗，5min×3 次。
13、DAB 显色：滴加显色液，室温显色，镜下控制反应时间，一般在 3 至 10min 之间。反应至显微镜下可见
第二天
8、取出昨天过夜的湿盒，37 度复温 30min，PBST 冲洗 5min×3 次。
9、滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔 IgG（B 试剂），37 孵育 30 min。
10、PBST 冲洗 5minX3 次。
11、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液（C 试剂），37 孵育 30 min。
12、PBST 冲洗，5min×3 次。
13、DAB 显色：滴加显色液，室温显色，镜下控制反应时间，一般在 3 至 10min 之间。反应至显微镜下可见
棕褐色颗粒为止，蒸馏水终止反应，并用蒸馏水洗涤。显色前先准备好双蒸水，切片从显微镜上拿下来后直接入水中。
14、苏木素复染。4min 后流水冲洗。（苏木素复染时间一般 3min 即可，视具体情况而定）
15、分化：1%盐酸酒精（实验室有专门的缸，不用自备）中浸泡，之后流水冲洗。（分化时间一般为 1-2s，即将切
14、苏木素复染。4min 后流水冲洗。（苏木素复染时间一般 3min 即可，视具体情况而定）
15、分化：1%盐酸酒精（实验室有专门的缸，不用自备）中浸泡，之后流水冲洗。（分化时间一般为 1-2s，即将切
片迅速浸入盐酸酒精中后迅速提起）
16、蓝化：氨.水中浸泡 30s~1min，之后流水冲洗。我们的蓝化直接是将切片浸入水中浸泡 10min 就可以了。
17、脱水：分别在 70%酒精、80%酒精、95%酒精、无水乙醇，无水乙醇各3min。（这些实验室有专门的缸，不用自备）
16、蓝化：氨.水中浸泡 30s~1min，之后流水冲洗。我们的蓝化直接是将切片浸入水中浸泡 10min 就可以了。
17、脱水：分别在 70%酒精、80%酒精、95%酒精、无水乙醇，无水乙醇各3min。（这些实验室有专门的缸，不用自备）
18、透明：二甲..苯，二甲.苯中浸泡各
10min，晾干。（同上）
19、中性树脂封片，显微镜观察。（封片可干封也可湿封，湿封即浸泡完二甲.苯之后不晾干，切片从二甲.苯中捞出后迅速
19、中性树脂封片，显微镜观察。（封片可干封也可湿封，湿封即浸泡完二甲.苯之后不晾干，切片从二甲.苯中捞出后迅速
滴加树脂盖上盖玻片）
各种液体配制方法：
抗原修复液中涉及到的液体：
A 液——枸橼酸（柠檬酸）5.2525g+双蒸水 250ML（易长毛，长毛后需重配）
B 液——枸橼酸钠（柠檬酸钠）14.705g+双蒸水 500ML
抗原修复液——A 液 4.5ML+B 液 20.5ML+双蒸水 225ML
3%双.氧.水——90ML 双蒸水+30%双..氧.水 10ML
PBS——磷酸氢二钠 14.5g+氯化钠 40g+1g+磷酸二氢钾 1g+双蒸水 5L
PBST——PBS 2L+（Tween-20） 1ML
DAB 显色剂（配制时请关灯避光）——1ML 双蒸馏水加入 DAB 显色试剂盒中的 A 液
一滴后混匀，再加入 B 液、C 液各一滴混匀即刻，避光保存，30min 内使用，
各种液体配制方法：
抗原修复液中涉及到的液体：
A 液——枸橼酸（柠檬酸）5.2525g+双蒸水 250ML（易长毛，长毛后需重配）
B 液——枸橼酸钠（柠檬酸钠）14.705g+双蒸水 500ML
抗原修复液——A 液 4.5ML+B 液 20.5ML+双蒸水 225ML
3%双.氧.水——90ML 双蒸水+30%双..氧.水 10ML
PBS——磷酸氢二钠 14.5g+氯化钠 40g+1g+磷酸二氢钾 1g+双蒸水 5L
PBST——PBS 2L+（Tween-20） 1ML
DAB 显色剂（配制时请关灯避光）——1ML 双蒸馏水加入 DAB 显色试剂盒中的 A 液
一滴后混匀，再加入 B 液、C 液各一滴混匀即刻，避光保存，30min 内使用，
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