基本信息

货号：15260

储存条件：保存在冰箱里，避光

适用仪器：吸光板酶标仪

简介

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是在细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中，NADP是一种在光合作用的初步反应中很重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。

现有的NAD / NADH方法具有低灵敏度和高干扰，因为测定在UV范围内进行。 我们的Amplite™比色总NAD和NADH检测试剂盒为敏感检测NAD和NADH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH，其显着提高了检测灵敏度。 此外，该测定具有非常低的背景，因为其在较长波长范围内进行，这显着降低了生物样品引起的干扰。 也没有必要从样品混合物中纯化NAD / NADH。 该试验证明了高灵敏度和低约576nm处吸光度的干扰。

Amplite™比色NAD / NADH检测试剂盒提供灵敏的一步法检测，可在100μL检测体积（300 nM;图1）中检测少至30皮摩尔的NAD（H）。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可通过吸光度酶标仪在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下轻松读取，以提高测定灵敏度。

试剂盒特点

广泛应用：可用于量化溶液和细胞提取物中的NAD / NADH。

敏感：在溶液中检测低至30皮摩尔的NAD / NADH。

连续性：无需分离步骤即可轻松适应自动化。

方便：配方具有最小的手动操作时间。 不需要洗涤。

非放射性：对废物处理没有特殊要求。

试剂盒组成

96孔板的检测方案

简要概括

准备NAD / NADH反应混合物（50μL）®

添加NADH标准品或测试样品（50μL）®

在室温下孵育15分钟 - 2小时®

监测吸光度在575±5 nm处增加

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作步骤

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol /μL）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 oC。

2.准备NAD / NADH反应混合物：

将10mL NAD / NADH传感器缓冲液（组分B）加入NAD / NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：此解决方案足以用于两个96孔板。 任何未使用的NAD / NADH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20。

3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至10μM）：

3.1将10μL的NADH储备液（来自步骤1）加入990μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，生成10μM稀释的NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10μM标准溶液进行1：3连续稀释，得到NADH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM连续稀释液。

3.3如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

表1白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

表2每个孔的试剂组成

注意：*将连续稀释的NADH标准品（0.01μM至10μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）可能由于NADH传感器的过度氧化而导致信号降低。

4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定：

4.1将50μLNADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.3）的每个孔中，使总NADH测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读数仪在575±5 nm或吸光度比为~570 nm至~605 nm下监测吸光度的增加，以提高检测灵敏度。

注1：对于NAD / NADH比率测量，建议使用套件15263。

注2：对于基于细胞的NAD / NADH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（Cat#20012）裂解细胞。

数据分析

空白孔中的吸光度（仅使用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。

注意：吸光度背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的吸光度非常重要。

图1.使用NOVOStar（BMG Labtech）酶标仪在白色/透明底96孔板中用Amplite TM比色Totlal NAD和NADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 在孵育1小时（n = 3）时可以检测到低至300nM（30pmol /孔）的NADH，而NADPH没有响应。

参考文献

1. Ziegenhorn J, Senn M, Bucher T. (1976) Molar absorptivities of beta-NADH and beta-NADPH. Clin Chem, 22, 151.

2. Ikegami T, Kameyama E, Yamamoto SY, Minami Y, Yubisui T. (2007) Structure and Properties of the Recombinant NADH-Cytochrome b(5) Reductase of Physarum polycephalum. Biosci Biotechnol Biochem.

3. Kimura N, Fukuwatari T, Sasaki R, Shibata K. (2006) Comparison of metabolic fates of nicotinamide, NAD+ and NADH administered orally and intraperitoneally; characterization of oral NADH. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 52, 142.

4. O'Donnell JM, Kudej RK, LaNoue KF, Vatner SF, Lewandowski ED. (2004) Limited transfer of cytosolic NADH into mitochondria at high cardiac workload. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 286, H2237.