基本信息

 

货号：15276（assays）

储存条件：保存在冰箱并避光

适用仪器：酶标仪

 

简介

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是在细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定基于监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化。 NAD / NADH和NADP / NADPH的短紫外波长

分析使传统方法具有低灵敏度和高干扰。 AAT Bioquest的Amplite™比色总NADP / NADPH检测试剂盒为检测总NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH。无需从样品混合物中纯化NADP / NADPH。酶循环反应显着提高了检测灵敏度。 NADPH探针是一种生色传感器，在NADP减少时具有460nm的最大吸光度。 NADPH探针的吸收与溶液中NADPH的浓度成正比。 Amplite™比色总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的分析，可在100μL分析体积中检测低至0.03μM的总NADP / NADPH。与套件＃15260相比，该套件具有更高的灵敏度。

 

试剂盒组成

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96孔板测定方案

 

简要总结

准备NADP / NADPH反应混合物（50μL）®

添加NADPH标准品或测试样品（50μL）®

在室温下孵育15分钟至2小时®®

监测460 nm处的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个

 

步骤

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol /μL）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 oC。

2.制备NADP / NADPH反应混合物：

2.1将8 mL NADPH探针缓冲液（组分B-II）加入到NADP / NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

2.2将2 mL NADPH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。

注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以进行200次分析。 未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20。

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至2μM）：

3.1将2μL的1mM NADPH储备液（来自步骤1）加入998μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，得到2μM（2 pmols / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL的2μMNADPH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到1，0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0mM系列稀释的NADPH标准品。

3.3如表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。 （详见附录）。

 

 

表1：白色/透明底96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

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注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

表2：每个孔的试剂组成

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*注意：将连续稀释的NADPH标准品（0.0313μM至2μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADPH（例如，>30μM，最终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

4.在上清液反应中运行NADPH测定：

4.1将50μL的NADP / NADPH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔

注1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNAP/ NADPH反应混合物。

注2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。 （详见附录）。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3使用吸光度读板仪在460 nm处监测吸光度的增加。

 

数据分析

空白孔中的吸光度（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。

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图1。 使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices），在96孔白色/透明底板中用Amplite TM比色总NADP和NADPH测定试剂盒*增强灵敏度*测量NADPH剂量反应。 孵育1小时（n = 3）可以检测到低至0.03μM的NADPH，在460nm处测量吸光度。

附录：使用组分D（裂解缓冲液）的测试样品制剂

 

1.植物细胞样品：用200mg / mL的裂解缓冲液均质化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

2.细菌细胞样品：离心收集细菌细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500离心 转速5分钟，用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样品：从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

4.组织样品：称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。

 

 

参考文献

1. Eugenia Villa-Cuesta, Marissa A. Holmbeckand David M. Rand. Journal of Cell Science (2014) 127, 2282–2290 doi:10.1242/jcs.142026.

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4. Stephen Y. Xue, Valeria Y. Hebert, Danicia M. Hayes, Corie N. Robinson, Mitzi Glover, and Tammy R. Dugas. Toxicol. Sci., Aug 2013; 134: 323 - 334. 5. Kate J. Roberts, Andrew Cross, Olga Vasieva, Robert J. Moots, and Steven W. Edwards. J. Leukoc. Biol., Sep 2013; 94: 481 - 492.

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8. Jaime Uribarri, Weijing Cai, Maya Ramdas, Susan Goodman, Renata Pyzik, Xue Chen, Li Zhu, Gary E. Striker, and Helen Vlassara. Potential role of AGER1 and SIRT1. Diabetes Care 2011; 34: 1610 - 1616.