加载中…SDS-PAGE的一些小技巧
(2014-10-10 10:53:58)
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sds-page实验总结 |
分类： 行业新闻 |
老板：“今天某某实验没做好是为什么？”
某同学：“……”
老板：“今天某某实验没出结果是什么原因？”
某同学：“……”
老板：“今天某某实验为什么会是这样的结果呢？”
某同学：“……”
（此时这个某同学心里在想，老板呀，我何尝不想把实验做出来，只是这实验实在不顺利啊！）
这些是平时我们在实验室经常听到的对话，美仑生物技术部的小编曾是那千万个某同学之一。事后仔细一查找原因，往往是因为一点小小的细节没有注意到才导致了实验的功亏一篑。下面美仑生物小编将和您一起讨论一下分子生物学上非常基本又非常重要的蛋白质电泳实验——SDS-PAGE的一些实用小技巧。
被称为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）到底是怎样一个实验呢？我们先来认识一下它几个重要部分的作用：
（A）
（B）
（C）SDS：一个带着大量负电荷的包裹，用过量的负电荷将蛋白质团团围住，其结果就是无论原来蛋白带的电荷如何，分子量如何，都将被视为带有相同量的负电荷。另外它也有取消蛋白分子内的疏水作用、解离蛋白质之间氢键的功能；
（D）TEMED与AP：促凝作用，使聚丙烯酰胺快速凝固；
（E） 制胶缓冲液：形成凝胶合适蛋白在其间穿梭的环境，一般选择Tris-HCl系统，浓缩胶pH6.7，分离胶pH8.9。
SDS-PAGE的原理和基本过程相信大家基本上都已经了解，网上搜一下也有很多的资源和讲解，但我们在跑SDS-PAGE的时候，仍然会出现各种奇怪的情况，对应的情况我们有什么样的小技巧来应对呢？下面以问答的形式给大家列举一些我们常会遇到的问题：
Q：跑完的胶怎么部分蜷缩变形？
A：很多同学一直沿用师兄师姐传下来的方法进行电泳，高电压进行的电泳会产生大量的热而导致胶层变形，如果改用低电压则会好很多。你会发现低电压的泳道会比高电压泳道跑的直一些，且分离效果更好，最适合于分子量相差不大的蛋白分离。如果你发现电泳的胶变形，不妨调低一点电压试试。
Q：会“微笑”的条带？
A：跑电泳过程有时条带不呈一条直线，而是有弧度，一般是由于凝胶的部分凝固不均所致，多出现于较厚的凝胶中。解决方法是配制凝胶时要充分混合（混合时间最好大于30s，视环境温度而定），充分凝固再做后续实验。
Q：采用小电压跑电泳要等待至少2个小时，太痛苦啦！
A：采用小电压跑效果虽然好，但遇到时间紧或只是作为试验实验的时候我们也可以采用150V左右的高电压，如果有条件的话可以将整个电泳装置放在冰冷环境中（比如盛满冰水的脸盆）充分散热，跑出的效果同样是很不错哒，关键是很省时间！
Q：条带出现拖尾现象？
A：这是因为样品没有制备好或分离胶浓度过大。处理办法：用适当的样品缓冲液和适量样品促溶剂，制备样品时使其充分变性（适用于变性电泳）。
Q：泳道顶端出现未知条带或加样孔底部有沉淀？
A：主要由于还原剂失活，原来被解离的分子重新缔合成大分子，分子量比目标条带大太多，不能进入分离胶。处理办法：煮沸样品后再添加少量DTT或巯基乙醇，以补充不足的还原剂。
Q：为什么电泳电压很高而电流却很低？
A：即使经常跑电泳的老手也会偶尔出现这样的问题。电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。处理办法：把电泳槽重新正确装配一次即可。第一次出现这样的情况可能会使你手足无措，不过相信下一次你就知道了。
Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？
A：一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。
Q：这都2个小时啦，我的胶为什么还不凝？
A：这种情况首先要在过硫酸铵（APS）上找原因，检查是否过期了，APS配制后会慢慢分解，一般4℃一周内使用为宜；另外一个就是要检查TEMED是否过期失效。
Q：凝胶太脆，易断，一拿起来就断了？
A：是APS用量出问题了。配置的APS浓度过高或是有的同学发现高浓度的APS会使凝聚时间变短，贪图凝聚速度却使得胶聚合得不好，这时胶会比较脆，无论在拆卸还是转移等过程胶非常易碎，这样绝对是得不偿失的。解决方法：严格按实验用量制备，有时APS部分过期变质导致的胶不凝也不要随意加量，要换新的APS。
另外有的论坛上贴出“寻找SDS-PAGE上样孔”的小技巧，这也是小编以前做实验时令人头疼问题，尤其是老式的电泳槽会出现这样的情况，大家可以查找一下，大致是在浓缩胶内加一些溴芬蓝，就是这么简单！一般加入 0.003% 就足够了，看起来效果还不错！
好了，就给大家介绍到这里，你们的支持就是我们的动力，美仑生物祝各位同学实验顺利，生活愉快！
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