一、实验目的

·通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。

二、实验原理

·感受态细胞(Competent cells):

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl₂，等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent  cell) 。

·转化（transformation）：

是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。

进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

·转化的方法：

(1)化学的方法:使用化学试剂（如CaCl₂）制备的感受态细胞，通过处理将载体DNA分子导入受体细胞；

(2)电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。

·克隆的筛选：

主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；

将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。

·重组DNA转化细菌过程示意图如左：

三、实验器材与试剂

试剂：CaCl₂、E.coli、LB液体培养基、质粒DNA

器材：取液枪、离心机、酒精灯、玻璃棒、保温箱、培养皿

四、实验步骤

1．大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl₂法)

(1) 从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液以1:100～1:50转接于200ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养（约2－3小时）；

(2) 每人取1个离心管，转入1.5ml培养液，在冰上冷却2-3min，于4℃，5000rpm／min离心5min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；

(3) 倒净上清培养液，按照0.75ml/管，用冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，，冰浴15 min ；

(4) 5000rpm／min离心5min；

(5) 弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置2小时后，即制成了感受态细胞悬液；

(6) 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％－20％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。

2．细胞转化

(1)     取1 µl质粒DNA加入 100µl感受态细胞，轻轻摇匀，冰上放置30min，

(2)     于42℃水浴中保温1min，然后迅速冰上冷却2min

(3) 立即向上述管中分别加入1mlLB液体培养基，摇匀后于37℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)（该步骤可以省略）。

3．平板培养

(1) 取各样品培养液20ul或50µl，涂布于含Amp抗菌素的LB平板培养基上，（用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。

(2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)。

·用CaCl₂法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA产生5´106-2´107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。

五、实验结果

·E.coli菌种生长较好，涂布也比较均匀，只是密度稍高，菌落间距离较近。

（我选择的是30µl）

类似的菌落生长效果图如左

六、注意事项

·悬浮细胞时要小心，用枪头轻轻吹起细胞即可,否则会影响细菌活性

·涂布前玻璃棒要充分冷却，不然会因温度过高而烫死细菌

·涂布时，尽量每个角落都要涂到，在一个角度涂布后，要顺时针转90度再涂布，连续转两次

·注意无菌操作

·操作过程中要尽量迅速以保证细菌细胞的活性

七、讨论

·为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度　

2. 质粒的质量和浓度　　

3. 试剂的质量　　

4. 防止杂菌和杂DNA的污染